白背葉根抗鴨乙肝病毒的實驗研究.pdf

1、研究背景：乙型肝炎病毒感染是一項全球性公共健康問題。在全世界大約20億感染過乙型肝炎病毒人群當(dāng)中，超過3億5千萬是慢性乙型肝炎病毒攜帶者。大約15％-40％的感染者將會發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭，甚至原發(fā)性肝癌。乙型肝炎病毒感染每年導(dǎo)致500，000到1，200，000病人死亡，它已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)第十大致死病因。由乙型肝炎病毒導(dǎo)致的原發(fā)性肝癌發(fā)病率不斷提高，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為第五最常見的惡性腫瘤，每年的病死率為300，000-50

2、0，000。目前，包括亞洲、歐洲和北美在內(nèi)，全世界范圍內(nèi)得到批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎的藥物主要有兩種：傳統(tǒng)的α干擾素和以拉米夫定為代表的核苷類似物。常規(guī)的α干擾素有著抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，成為治療慢性乙型肝炎的選擇。對α干擾素持續(xù)應(yīng)答的患者有著較好的預(yù)后，生存質(zhì)量高而較少并發(fā)癥。然而，普通α干擾素有效率較低的同時也有較多的副作用，一周三次的注射劑量治療給患者生活上帶來了諸多不便。相比普通α干擾素，拉米夫定的優(yōu)勢在于較少的副作用和方

3、便的服藥方案。它的缺點也同樣在于較低的有效率以及需要長期的治療以維持應(yīng)答，但是隨著治療療程的延長，拉米夫定有較高的病毒耐藥率。 祖國醫(yī)學(xué)并沒有相應(yīng)的“肝炎”這一病名，也未對它做出明確細(xì)分；根據(jù)病毒性肝炎臨床特征與中醫(yī)病癥的相似性把它歸屬于“黃疸”、“肝郁”、“脅痛”、“積聚”。早在漢代(公元前206-公元前220年)，諸如脅肋疼痛、黃疸、腹脹、黑尿、便溏等癥狀已經(jīng)在醫(yī)學(xué)典籍中提到。在著名的中醫(yī)經(jīng)典《金匱要略》中就肝郁證和痞滿證作

4、了詳細(xì)闡述。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝炎是由于肝臟本身陰陽失調(diào)導(dǎo)致，濕熱毒邪和瘀血凝滯是其基本病因病機(jī)。在1991年9月中華全國中醫(yī)學(xué)會內(nèi)科肝病專業(yè)委員會制定了病毒性肝炎中醫(yī)辨證論治的診斷標(biāo)準(zhǔn)，該診斷標(biāo)準(zhǔn)將慢性肝炎分為5個證型：濕熱中阻、肝郁脾虛、肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)、脾腎陽虛。根據(jù)病因病機(jī)，相應(yīng)總的治則為清熱解毒祛濕、理氣活血、疏肝健脾。在臨床上，將中醫(yī)辨證和西醫(yī)的辨病結(jié)合在一起，采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法。在實踐中發(fā)現(xiàn)，與上述兩種西藥相比，傳統(tǒng)中

5、藥在長期治療慢性乙型肝炎過程中體現(xiàn)了它獨有的優(yōu)勢，中藥通過對機(jī)體的整體調(diào)節(jié)因而療效穩(wěn)定、毒副作用小。目前不僅在國內(nèi)，西方許多國家對治療慢性病毒性肝炎的中草藥的應(yīng)用也越來越受歡迎。其原因是多方面的，首要的在于目前已知的藥物當(dāng)中沒有一種可以較好地清除病毒，幾乎所有經(jīng)受治療的患者在停藥后體內(nèi)乙肝病毒又有復(fù)制，患者不得不面對有可能終身服藥的這一嚴(yán)酷現(xiàn)實。因此各國的藥物學(xué)家都在嘗試尋找對乙肝病毒有效、對人安全、副作用小的天然藥物或有效成分。通過國

6、內(nèi)學(xué)者的努力，已經(jīng)證實一些中草藥具有抑制乙肝病毒復(fù)制的作用。中草藥治療慢性乙型肝炎的有效性在于它能促進(jìn)肝臟細(xì)胞的修復(fù)、保護(hù)細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)免疫功能和抑制病毒復(fù)制等方面。然而，不同的實驗方法所得出的結(jié)果常常不相一致；有必要建立一種可靠、準(zhǔn)確和重復(fù)性強(qiáng)的實驗方法以探究和客觀評價那些可能有臨床價值藥物的真正作用。 白背葉根是一種廣泛分布于我國的中草藥，其味苦、微澀，性平。據(jù)記載白背葉根具有清熱解毒的功效。導(dǎo)師呂志平教授在治療慢性乙型肝炎導(dǎo)

7、致肝纖維化的患者時，在辨證論治基礎(chǔ)上常常加用白背葉根，長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)白背葉根具有明顯的抗纖維化作用，還有一定的抑制乙肝病毒的效果。在我們前期的2.2.15細(xì)胞株實驗中發(fā)現(xiàn)，白背葉根在體外實驗具有抑制人乙型肝炎病毒復(fù)制的作用。 鴨乙肝病毒是第一種在鳥禽宿主體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的乙型肝炎病毒，它是肝DNA病毒科的一種。肝DNA病毒科的所有病毒都有著類似的染色體結(jié)構(gòu)和病毒復(fù)制模式，并引起種屬特異性的急性或慢性感染。鴨乙肝病毒的發(fā)現(xiàn)為研究人乙肝病

8、毒生物學(xué)特征和發(fā)病機(jī)制提供了便利的動物模型，而此前由于實驗方法或者倫理學(xué)的原因，這些研究遲遲未能開展。鴨感染鴨乙肝病毒后的肝臟表現(xiàn)與人類感染人乙肝病毒患者的肝臟病理表現(xiàn)相似，因此鴨乙型肝炎模型被認(rèn)為是理想的乙型肝炎動物模型，通過該模型可以獲取許多在乙型肝炎患者身上無法獲得的資料，尤其在評價抗乙肝病毒藥物療效中得到廣泛應(yīng)用。相比而言，許多其他乙型肝炎病毒動物模型或因不便于管理、過于昂貴(如土撥鼠和黑猩猩)，或者不適用于研究整個感染過程(如

9、帶有乙肝病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠)而受到應(yīng)用上的限制。 本實驗旨在明確白背葉根在體內(nèi)對鴨乙肝病毒有無抑制作用，并試與核苷類藥物拉米夫定的這一作用相比較。 第一部分PCR篩選D-HBV陽性廣州麻鴨 目的：從150只三日齡廣州麻鴨中篩選出D-HBV陽性樣品作為人乙肝病毒的動物模型用于白背葉根藥物療效的觀察與研究。 方法：從頸靜脈按編號依序從每只鴨子抽取0.1～0.2ml血漿，離心后取10μl上清。將上清與DNA提取液

10、混勻后沸水加熱，離心后加入PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增，反應(yīng)體系中上游引物：5'-AACCATTGAAGCAATCACTAGAC-3'；下游引物：5'-ATCTATGGTGGCTGCTCGAACTA-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物217bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后根據(jù)217bp附近有無條帶并與陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)分子量印跡比較，判斷是否為陽性。 結(jié)果：在總共150個待測樣本中，43份為陽性，陽性率為28.7％。 結(jié)論：廣州麻鴨雛鴨中的D-HBV自然感染率為

11、28.7％，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果接近。其陽性率較普通鴨種高，因此廣州麻鴨雛鴨是用于研究人乙肝病毒和篩選抗乙肝病毒藥物經(jīng)濟(jì)、方便的動物模型。 第二部分白背葉根抗鴨乙肝病毒的實驗研究 目的：明確白背葉根在體內(nèi)對鴨乙肝病毒的作用，將白背葉根和拉米夫定治療鴨乙肝病毒肝炎的療效進(jìn)行比較，初步探討白背葉根抗乙肝病毒的作用機(jī)制。 方法：將常規(guī)PCR篩選出的先天感染D-HBV的三日齡廣州麻鴨40只隨機(jī)分為5組：空白對照組(A組)、白背

12、葉根高劑量組(B組)、白背葉根中劑量組(C組)、白背葉根低劑量組(D組)和拉米夫定組(E組)；各組給予常規(guī)飼料、自由飲水；處理組分別給予不同劑量白背葉根(B組：30g.Kg-1.d-1;C組：20g.Kg-1.d-1;D組：10g.Kg-1.d-1)和拉米夫定(50mg.Kg-1.d-1)干預(yù)。治療前、治療中第7、第14、第21天及停藥后第7天用實時熒光定量PCR(SYBRGreenⅠ)動態(tài)檢測血清D-HBV濃度。反應(yīng)條件設(shè)定、熒光信號

13、檢測和數(shù)據(jù)的讀取均通過RocheLightcycleRun5.32軟件完成。治療前后分別取肝臟組織，HE染色觀察炎癥病理改變，地衣紅特殊染色觀察D-HbsAg含量的變化。各治療組療效比較用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；各時間點組間比較用單因素方差分析(LSD)法，所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。 結(jié)果：拉米夫定組用藥后血清病毒水平迅速降低，治療中一直維持較低水平。白背葉根高、中劑量組血清病毒含量下降分別在第14、21天開始顯效(與

14、空白對照組組間比較p＜0.05)，低劑量組治療期間未見抑制病毒的作用。停藥后白背葉根高、中劑量組與空白對照組比較仍表現(xiàn)一定的病毒抑制作用；而拉米夫定組血清病毒滴度有所回升，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示與空白對照組無顯著性差異(p＞0.05)；此時與白背葉根高劑量組比較亦無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，肝臟病理證實白背葉根減輕肝臟炎癥較拉米夫定明顯。 結(jié)論：白背葉根確實對D-HBV引起的肝炎有治療作用，它不僅能夠體內(nèi)抑制病毒的復(fù)制，而且減輕肝臟的炎癥。這種