新型FOXM1抑制劑RCM1對支氣管哮喘小鼠的治療作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 新型化合物RCM1對氣道上皮club細(xì)胞內(nèi)FOXM1的作用研究
　　目的:驗證新型化合物RCM1在體內(nèi)對轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的抑制作用。
　　方法:使用CC SP-rtTAtg/-/tetO-FOXM1tg/-轉(zhuǎn)基因鼠，鼻內(nèi)滴入屋塵螨(House Dust Mite，HDM)經(jīng)DOX刺激后氣道上皮club細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)FOXM1，采用RCM1腹腔注射進行干預(yù)，觀察轉(zhuǎn)基因鼠氣道上

2、皮細(xì)胞內(nèi)FOXM1表達(dá)情況，并同時使用Rael-time PCR、免疫組織化學(xué)染色及Western Blot進行研究。
　　結(jié)果:經(jīng)HDM氣道內(nèi)刺激并經(jīng)DOX激發(fā)后，轉(zhuǎn)基因鼠氣道上皮club細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)FOXM1，熒光顯微鏡觀察可見RCM1明顯抑制club細(xì)胞FOXM1表達(dá)，Rael-time PCR、免疫組織化學(xué)染色及Western Blot也證實RCM1明顯抑制club細(xì)胞內(nèi)Foxm1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)論:

3、RCM1可明顯抑制轉(zhuǎn)基因鼠氣道上皮club細(xì)胞表達(dá)FOXM1。
　　第二部分 FOXM1抑制劑RCM1對支氣管哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及氣道炎癥反應(yīng)的作用研究
　　目的:探索RCM1對支氣管哮喘模型小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生、肺部炎癥及氣道高反應(yīng)性的作用。
　　方法:使用HDM氣道激發(fā)Balb/c小鼠制備支氣管哮喘急性期模型，采用腹腔注射RCM1方式進行干預(yù)，實驗鼠分為四組:A組:生理鹽水滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;B組:生

4、理鹽水滴鼻+腹腔注射RCM1;C組:HDM滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;D組:HDM滴鼻+腹腔注射RCM1。在進行最后一次HDM氣道內(nèi)激發(fā)后24小時獲取標(biāo)本，進行下列檢測:(1)肺組織Real-time PCR定量檢測氣道杯狀細(xì)胞化生相關(guān)基因Fxom1、Spdef、Foxa2、Foxa3、Scgb1a1、Agr2、Muc5ac及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因Ccl2、Ccl11、Ccl24、Ccr2、Ccr3、Cx3cl1、Cx3cr1、IL-4、IL

5、-5、IL-12p35、IL-13、IL-33、Acta2、Ptgs2、Ltc4smRNA水平;(2)進行肺組織HE、Alcian Blue及免疫組織化學(xué)染色評估氣道杯狀細(xì)胞化生、粘液分泌、炎癥反應(yīng)及氣道上皮細(xì)胞內(nèi)FOXM1、SPDEF、MUC5AC、FOXA2、CCSP表達(dá)情況，肺組織學(xué)評分評估肺組織炎癥反應(yīng)程度;(3)支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細(xì)胞計數(shù)并使用流式細(xì)胞儀分析肺泡巨噬細(xì)胞、浸潤巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T

6、淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的變化;(4)測定BALF中IFN γ、IL-4、IL-5、IL-13細(xì)胞因子水平;(5)使用乙酰甲膽堿進行氣道激發(fā)，F(xiàn)lexiVent系統(tǒng)進行氣道動力學(xué)參數(shù)測定，觀察支氣管哮喘小鼠氣道阻力、氣道順應(yīng)性、中心氣道及周圍氣道阻力變化情況。
　　結(jié)果:(1) RCM1有效抑制HDM誘發(fā)的Balb/c小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞化生，減輕氣道粘液過度分泌，降低肺組織內(nèi)Fxom1、Spdef、 Foxa3、Agr2、Muc5a

7、c表達(dá)，有上調(diào)Foxa2及Scgb1a1轉(zhuǎn)錄，增加FOXA2、CCSP表達(dá)趨勢，并減少氣道上皮細(xì)胞內(nèi)FOXM1、SPDEF、MUC5AC表達(dá)。(2) RCM1明顯減輕HDM誘發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)，降低炎癥趨化因子Ccl2、Ccl11、Ccl24、Ccr2、Ccr3及細(xì)胞因子IL-5、IL-13、IL-33 mRNA水平，下調(diào)BALF內(nèi)IL-4、IL-5、IL-13水平，并上調(diào)IFNγ水平，減少HDM導(dǎo)致的肺組織學(xué)評分升高;(3) RCM1

8、未減少HDM誘發(fā)的BALF中細(xì)胞數(shù)增多，但可明顯減少T淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的數(shù)量;(4) RCM1可明顯降低氣道阻力，提高肺組織順應(yīng)性。
　　結(jié)論:RCM1可有減輕支氣管哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生、氣道粘液分泌及肺組織炎癥，并可降低氣道阻力，提高肺組織順應(yīng)性。RCM1有潛力成為治療哮喘的新型藥物。
　　第三部分 FOXM1抑制劑RCM1對IL-13誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)的作用及機制研究
　　目的:觀察FOXM1抑制劑RCM1

9、對IL-13誘導(dǎo)的氣道杯狀細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)的作用，并結(jié)合體外實驗探索RCM1的作用機制。
　　方法:1.體內(nèi)實驗:使用重組鼠IL-13氣道激發(fā)Balb/c小鼠制備氣道炎癥模型，采用腹腔注射RCM1方式進行干預(yù)，實驗鼠分為四組:A組:生理鹽水滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;B組:生理鹽水滴鼻+腹腔注射RCM1;C組: IL-13滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;D組:IL-13滴鼻+腹腔注射RCM1。在進行最后一次IL-13氣道內(nèi)激發(fā)后24

10、小時獲取標(biāo)本，進行下列檢測:(1)肺組織Real-time PCR定量檢測氣道杯狀細(xì)胞化生相關(guān)基因Fxom1、Spdef、 Foxa2、Foxa3、Scgb1a1、Agr2、Muc5ac及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因Ccl2、Ccl11、Ccl20、Ccl24、Ccr3、Ccr6、Cx3cl1、Cx3cr1、Ifng、IL-4、IL-5、IL-12p35、IL-13、IL-25、IL-33、Acta2、Ptgs2、Ltc4smRNA水平;(2)進行

11、肺組織HE、Alcian Blue及免疫組織化學(xué)染色評估氣道杯狀細(xì)胞化生、粘液分泌、炎癥反應(yīng)及氣道上皮細(xì)胞內(nèi)FOXM1、SPDEF、MUC5AC、FOXA2表達(dá)情況;(3)支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細(xì)胞計數(shù)及分類分析，測定BALF中IFNγ、 IL-4、IL-5、IL-33細(xì)胞因子水平;(4) Western Blot測定肺組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXM1、STAT6、p-STAT6、ERK 1/2、p-ERK 1/2、AKT、p-AKT

12、、ERK5、p-ERK5、14-3-3水平，以β-actin作為內(nèi)參;(5)使用乙酰甲膽堿進行氣道激發(fā)，F(xiàn)lexiVent系統(tǒng)進行氣道動力學(xué)參數(shù)測定，觀察實驗小鼠小鼠氣道阻力、氣道順應(yīng)性、中心氣道及周圍氣道阻力變化情況。(6)留取實驗鼠外周血血清檢測各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)、尿素氮(BUN)、總蛋白(Total Protein)、白蛋白(Albummin)、堿性磷酸酶(ALP)水平變化，并對

13、小腸絨毛進行形態(tài)學(xué)觀察。2.體外實驗:對正常人氣道上皮細(xì)胞(NHBE cells)進行體外培養(yǎng)，加入重組人IL-13（10ng/μL）進行刺激前1小時用RCM1進行干預(yù)，2-24小時收集細(xì)胞，Western Blot法檢測細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子FOXM1、STAT6、p-STAT6、ERK 1/2、p-ERK 1/2、AKT、p-AKT、ERK5、p-ERK5、14-3-3水平，以β-actin作為內(nèi)參。
　　結(jié)果:(1) RCM1有效抑

14、制IL-13誘發(fā)的Balb/c小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞化生，減輕氣道粘液過度分泌，降低肺組織內(nèi)Fxom1、Spdef、 Foxa3、Muc5ac表達(dá)，并減少氣道上皮細(xì)胞內(nèi)FOXM1、SPDEF、MUC5AC表達(dá)，對Foxa2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)無明顯影響，對IL-13上調(diào)Agr2及下調(diào)Scgb1a1表達(dá)無明顯影響;(2)RCM1明顯減輕IL-13誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)，降低炎癥趨化因子Ccl2、Ccl11、Ccl24及細(xì)胞因子IL-4、IL-5、

15、IL-13、IL-25、IL-33 mRNA水平，下調(diào)BALF內(nèi)IL-4、IL-5水平，IL-13促進BALF中IL-33升高，RCM1未對其產(chǎn)生影響，IL-13及RCM1對肺組織中Ccl20、Ccr3、Ccr6、Cx3cl1、Cx3cr1、IL-12p35、Acta2、Ptgs2 mRNA水平無明顯影響;(3) IL-13及RCM1對BALF中細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量無明顯影響;(4) RCM1可明顯

16、降低IL-13所導(dǎo)致的實驗小鼠氣道阻力升高及肺組織順應(yīng)性降低，起到保護肺功能作用。(5)利用肺組織及NHBE細(xì)胞進行Western Blot檢測顯示，RCM1可有效抑制IL-13刺激所導(dǎo)致的FOXM1表達(dá)增強，RCM1也抑制了ERK 1/2的總量及磷酸化水平，IL-13及RCM1對STAT6、p-STAT6、AKT、p-AKT、ERK5、p-ERK5、14-3-3無明顯影響。(6) RCM1對實驗小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶