枯草桿菌蛋白酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及體外溶栓性質(zhì).pdf

1、隨著我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象的日益嚴(yán)重,老年常發(fā)疾病血栓栓塞性疾病的發(fā)生也極為普遍,這種疾病也是當(dāng)前致死率很高的病因之一,治療這類疾病的主要手段則是溶栓療法,而纖溶酶主要是催化血栓中的主要成分纖維蛋白水解,從而達(dá)到溶解血栓的目的,纖溶酶可來源于動(dòng)物、植物、微生物,而微生物則是纖溶酶的主要來源,枯草芽孢桿菌是人類最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌,由于它的生長(zhǎng)環(huán)境多樣,自身沒有致病性,對(duì)高溫、高熱、電磁輻射、紫外線等具有很強(qiáng)抗逆性,它可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多種多樣,且能

2、直接將許多蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中,產(chǎn)生各種各樣的酶,一直是生物界研究熱點(diǎn)。
　　本文采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存菌種枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行分離純化,測(cè)定了枯草桿菌蛋白酶中具有纖溶活性蛋白酶的部分酶學(xué)性質(zhì),并研究其體外溶栓特點(diǎn),為后續(xù)工作的展開奠定了基礎(chǔ)。
　　1、為提高枯草桿菌蛋白酶的產(chǎn)量,采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),通過搖瓶培養(yǎng)對(duì)枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,優(yōu)

3、化后培養(yǎng)基(w/v)為:麥芽糖1％、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%;最適發(fā)酵條件為:初始pH7、溫度37℃、接種量為1%,最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h。
　　2、將枯草桿菌按最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h后,將發(fā)酵液進(jìn)行4℃、4000rpm離心20min,然后將發(fā)酵上清液加入60%飽和度的硫酸銨進(jìn)行鹽析、透析后冷凍干燥得到粗酶粉,然后利用CM-sepharose Fast Flow

4、對(duì)枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行分離純化,純化后得到純酶進(jìn)行 SDS-PAGE驗(yàn)證,最后得到的酶分子量顯示低于14.3KDa,且具有纖溶酶活性,前人文獻(xiàn)中未見報(bào)道,是一種新的溶栓酶。
　　3、為明確枯草桿菌蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì),研究了溫度、pH、金屬離子對(duì)其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,枯草桿菌蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60-70℃、溫度穩(wěn)定性范圍為40℃以下、最適反應(yīng)pH為7,pH穩(wěn)定性范圍為6-8,未發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)該酶活性的金屬離子。
　　4、研究了