植物生物反應(yīng)器的優(yōu)化研究.pdf

1、rl217346分類(lèi)號(hào)UDC密級(jí)：o“編號(hào)：0313301076咿幽撼勞博士學(xué)位論文植物生物反應(yīng)器的優(yōu)化研究學(xué)位申請(qǐng)人：一導(dǎo)師姓2廈職稱(chēng)生化與分子生物掌；o。七rF十=月=11摘要TBSV)的p19蛋白已被報(bào)道可以有效抑制PTGS而增強(qiáng)GFP蛋白在植物中的瞬時(shí)表達(dá)。在農(nóng)桿菌注射煙草葉片的實(shí)驗(yàn)中，p19蛋白可以使SARSCoVN蛋自的表達(dá)量在每克鮮重葉片中達(dá)到79峙，比沒(méi)有p19蛋白的對(duì)照提高了4倍。用含有SARSCoVN蛋白的植物提取液

2、對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，在小鼠血清中能檢測(cè)到N蛋白特異的抗體，同時(shí)小鼠脾中的細(xì)胞因子的表達(dá)水平產(chǎn)生了變化，說(shuō)明了植物表達(dá)的SARS—CoVN蛋白在小鼠中引起了特異的體液免疫和細(xì)胞免疫。許多重要的藥用蛋白必須經(jīng)過(guò)前體剪切和糖基化等翻譯后修飾才能成為有活性的蛋白，而且藥用蛋白可能會(huì)因?yàn)镹糖基化修飾的變化而喪失生物活性。植物與哺乳動(dòng)物的N一糖基化系統(tǒng)基本相同，但也存在一些差異，其中植物糖蛋白特異的B1’2一木糖和弘l，3巖藻糖糖基具有免疫原性

3、，可能會(huì)在動(dòng)物體中引起過(guò)敏反應(yīng)。我們?cè)O(shè)計(jì)了RNAi載體轉(zhuǎn)化植物來(lái)沉默這兩個(gè)糖基對(duì)應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。我們從煙草BY2細(xì)胞(NicotianatobacumLCVBrightYellow2)中擴(kuò)增出未曾報(bào)道的煙草Bl2木糖轉(zhuǎn)移酶的基因片斷和弘l，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的基因片段，這兩個(gè)片斷與其它植物物種的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的相應(yīng)區(qū)域具有很高的同源性。利用這兩個(gè)片斷分別構(gòu)建含有內(nèi)含子的自身互補(bǔ)的發(fā)夾RNA，并克隆到誘導(dǎo)性型載體和組成型載體中。煙草B_l

4、，2木糖轉(zhuǎn)移酶基因的RNAi片斷在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草BY2細(xì)胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后不能使aq2木糖糖基的含量明顯下降；但是煙草洳1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的RNAi片斷在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草BY2細(xì)胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后可以能al。3巖藻糖糖基的含量明顯下降。&1≯木糖轉(zhuǎn)移酶基因和ml，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的RNAi片斷在煙草(Nicotianatobacum)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄后可以降低注射的煙草葉片中Bl二木糖和al3巖藻糖的含量。植物表達(dá)的外源蛋白的分離和純化也是植物生

5、物反應(yīng)器的難題之一。利用融合蛋白的方式在植物中表達(dá)目的蛋白不但可簡(jiǎn)化外源蛋白的檢測(cè)，而且可以大大降低下游純化和分離的成本。但是為了避免融合短肽對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，通常會(huì)在純化的同時(shí)或者之后去除融合短肽。特異性蛋白酶可以識(shí)別由幾個(gè)特定氨基酸組成的位點(diǎn)而進(jìn)行切割，是去除融合短肽的有效工具。煙草花葉病毒(tobaccoetchvirus，TEV)NIa蛋白酶由于對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的高嚴(yán)謹(jǐn)性和高酶切活性而得到廣泛的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)李痘病毒(Plu