轉(zhuǎn)錄因子Spt6的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域識別RNA聚合酶IIC-端結(jié)構(gòu)域磷酸化修飾的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、RNA聚合酶II(RNAP II)負(fù)責(zé)了真核細(xì)胞中mRNA、microRNA和大多數(shù)的snRNA的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄過程中有大量的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors)參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的各個階段，RNAPII的C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)是眾多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的重要區(qū)域。RNAPII CTD是由幾十個(26至52)YSPTSPS氨基酸序列重復(fù)構(gòu)成，而且它的磷酸化修飾與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關(guān)。其主要磷酸化位點(diǎn)Ser2和Ser5在mRNA轉(zhuǎn)錄周期中

2、動態(tài)變化，在不同時期招募了各種調(diào)節(jié)因子，比如Spt6就是在轉(zhuǎn)錄延伸階段被Ser2位磷酸化所招募的延伸因子。
　　 Spt6是組蛋白H3:H4的分子伴侶，參與轉(zhuǎn)錄后染色質(zhì)重組裝(re-assembly)的，它的功能缺失會導(dǎo)致從基因編碼區(qū)內(nèi)部隱含啟動子(cryptic promoter)的轉(zhuǎn)錄起始，以及mRNA處理和出核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能障礙。Spt6行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能依賴于它和RNAPII CTD的結(jié)合，它通過一個非典型的SH2結(jié)構(gòu)域識別

3、了CTD的Ser2磷酸化(Ser2P)；這是第一個被證實能夠結(jié)合磷酸化絲氨酸而不是磷酸化酪氨酸的SH2結(jié)構(gòu)域，而且它是釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的唯一SH2結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化上可能代表了SH2家族的起源；因此，從分子結(jié)構(gòu)水平闡釋它的識別機(jī)理和分子進(jìn)化地位具有重要的意義。本研究報道了Spt6蛋白質(zhì)中一個全新的SH2結(jié)構(gòu)域，它與已報道的SH2結(jié)構(gòu)域域組成一個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域模塊。我們用溶液核磁共振技術(shù)和X射線晶體衍射解析了釀酒酵母和人類Spt6串聯(lián)SH2的結(jié)構(gòu)域

4、的三維結(jié)構(gòu)，研究了串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域模塊與RNAPII CTD的結(jié)合。
　　 第1章中簡略地回顧了RNAPII轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，特別是CTD磷酸化在其中所扮演的角色；同時綜述了Spt6蛋白質(zhì)的相關(guān)研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了其SH2結(jié)構(gòu)域的相互作用和功能。
　　 第2章詳細(xì)描述了釀酒酵母Spt6蛋白質(zhì)串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能研究。通過異核多維核磁共振，我們解析了它在溶液中的三維結(jié)構(gòu)；發(fā)現(xiàn)兩個串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域形成一個棒狀的整體結(jié)構(gòu)，

5、兩個結(jié)構(gòu)域之間存在一個保守的疏水核心；主鏈酰胺基團(tuán)的縱向、橫向弛豫時間(T1、T2)和異核[15N-1H]-NOE數(shù)據(jù)表明兩個SH2結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)域都具有一樣的動力學(xué)性質(zhì)，同時殘留偶極耦合(RDC)數(shù)據(jù)的分析也表明兩個SH2結(jié)構(gòu)域在溶液中具有相同的取向(orientation)?；瘜W(xué)位移擾動實驗證明串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多種磷酸化狀態(tài)的CTD多肽，包括Ser2P、Ser5P、Ser2PSer5P和Tyr1P，而且磷酸化多肽

6、的結(jié)合位點(diǎn)都位于第一個SH2結(jié)構(gòu)域(SH2N)的同一區(qū)域中，而第二個結(jié)構(gòu)域(SH2C)則沒有直接參與相互作用。GST pull-down實驗也表明Spt6的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域可以和細(xì)胞裂解液中的RNAPII結(jié)合。我們從結(jié)構(gòu)上分析了SH2N既能結(jié)合磷酸化絲氨酸，又能結(jié)合磷酸化酪氨酸的分子機(jī)制。SH2C的分子進(jìn)化分析表明它是一類新的SH2結(jié)構(gòu)域亞家族，而且和SH2N形成一個保守的且不可分割的結(jié)構(gòu)模塊，存在而且只存在于真核生物Spt6蛋白質(zhì)中。

7、
　　 第3章敘述了人類Spt6蛋白質(zhì)串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的X射線晶體學(xué)研究。我們用蛋白質(zhì)單晶收集了X射線衍射數(shù)據(jù)，進(jìn)一步用硒代晶體的單波長反常散射(MAD)獲得了相位信息，解析了2.3 ?的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)表明人類Spt6串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域與釀酒酵母有所不同，它的第一個結(jié)構(gòu)域SH2N的bE-bF區(qū)域發(fā)生了結(jié)構(gòu)域交換(domain-swapping)，形成同二聚；但是同一個單體分子的兩個串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的相對取向和堆積與釀酒酵母一樣，表

8、明這是一個結(jié)構(gòu)保守的模塊。凝膠過濾、分析型超速離心實驗和共表達(dá)實驗表明在溶液中人類串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域確實主要以二體形成存在。GST pull-down實驗同樣表明人類Spt6的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合細(xì)胞裂解液中的RNAP II。
　　 第4章描述了RNAPII CTD及其Ser2位點(diǎn)的激酶pTEFb復(fù)合物的表達(dá)純化。同過共表達(dá)，我們用大腸桿菌成功表達(dá)了人類Cdk9(2-330)和cyclin T1(1-272)片段的復(fù)合物。另外

9、我們嘗試了自行表達(dá)釀酒酵母和人類RNAPII的CTD片段，但是沒有成功，后來從其他研究組索取了小鼠CTD的表達(dá)質(zhì)粒，獲得了CTD重組蛋白質(zhì)。
　　 在本研究中，我們用不同方法解析了釀酒酵母和人類Spt6的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了一個存在于Spt6蛋白質(zhì)中新的SH2亞家族；滴定實驗還發(fā)現(xiàn)SH2N不僅結(jié)合磷酸化絲氨酸，也結(jié)合磷酸化酪氨酸，分子的三維結(jié)構(gòu)很好的解釋了它的底物多樣性，同時它與不同底物的親和力也很好的支持了Spt