香蕉根際土壤微生物區(qū)系特征與土傳枯萎病防控研究.pdf

1、植物長期連作容易引起植物病原微生物富集，植物有益微生物數(shù)量減少，土壤微生物區(qū)系從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成失衡，使病原菌更容易侵染植物而引起植物的各種土傳病害頻發(fā)，如連作土傳枯萎病。因此對土壤微生物區(qū)系的研究對防控植物連作土傳病害具有重要的意義。
　　本研究首先分析比較了不同的真菌標(biāo)靶基因(28S rRNA和ITS轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))以及鑒定數(shù)據(jù)庫(LSU，WARCUP和UNITE)對真菌微生物區(qū)系測序數(shù)

2、據(jù)分析結(jié)果的影響，得出適合用于本研究的真菌標(biāo)靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫;進(jìn)而通過比較健康與發(fā)病香蕉根際土壤微生物區(qū)系差異得出健康香蕉根際土壤微生物群落的指示類群;進(jìn)而篩選出能有效抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)OC)生長的拮抗菌;將該拮抗菌進(jìn)行全基因組測序，進(jìn)一步分析其生防潛力;通過比較基因組研究設(shè)計能夠精確定量該拮抗菌的特異性引物;進(jìn)而測試該拮抗菌在土壤中的存活能力;最

3、后將拮抗菌制成微生物有機肥(BIO),通過BIO營養(yǎng)缽育苗以及在田間穴施BIO在香蕉根際培育一個以有益微生物為主導(dǎo)的健康微生物區(qū)系，從而起到防控香蕉土傳枯萎病的目的。主要研究結(jié)果有以下幾點:
　　1.選用不同的真菌標(biāo)靶基因(ITS，28S rRNA)與真菌鑒定數(shù)據(jù)庫(LSU,UNITE和WARCUP)對玉米，芒草與柳枝稷根際真菌群落的研究都得到一致的結(jié)論:一年生作物（玉米）的根際的真菌類群最特殊，作物類型是影響其根際真菌區(qū)系的首要

4、因子。說明這些真菌標(biāo)靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫對揭示處理間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異沒有很大影響。盡管如此，受標(biāo)靶基因引物覆蓋度以及真菌鑒定數(shù)據(jù)庫的覆蓋度與復(fù)雜性的影響，標(biāo)靶基因與數(shù)據(jù)庫對真菌高通量測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果中的某些類群的相對豐度影響顯著。使用28S rRNA標(biāo)靶基因未能檢測到Fusarium，Phoma和Verticillum等真菌類群，而這些類群在使用ITS標(biāo)靶基因得到的分析結(jié)果中屬于相對豐度非常高的主要真菌類群，這些類群包含了著名的植物病原

5、菌;而使用ITS標(biāo)靶基因未能檢測到Orbicula等真菌類群;Eupenicillium在使用ITS標(biāo)靶基因配合UNITE數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果中沒有出現(xiàn)，在ITS標(biāo)靶基因配合WARCUP數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中占比較小，而在28S rRNA配合LSU數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中為第四名豐度最高的真菌類群。由于使用WARCUP數(shù)據(jù)庫對ITS序列進(jìn)行鑒定的結(jié)果在可鑒定類群數(shù)量與比例，鑒定結(jié)果有效性等方面都要優(yōu)于UNITE數(shù)據(jù)庫，并且鑒于Fusarium真菌屬包

6、含了本研究香蕉枯萎病的病原菌FOC，對本研究的意義重大，因此本研究關(guān)于香蕉根際真菌區(qū)系的研究選用ITS標(biāo)靶基因配合WARCUP真菌ITS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。
　　2.香蕉根際微生物區(qū)系與香蕉植株健康狀況息息相關(guān)。16S rRNA基因克隆建庫測序的結(jié)果表明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對豐度最高的細(xì)菌類群;高通量測序結(jié)果表明，Bacillus是健康與發(fā)病香蕉植株根際細(xì)菌區(qū)系差異的主要貢獻(xiàn)者之一，是健康香蕉根際細(xì)菌區(qū)系的指示類群。健康

7、的樣品中Bacillus的相對豐度顯著高于發(fā)病樣品。Fusarium是發(fā)病香蕉根際土壤中的主要類群，其在發(fā)病香蕉樣品中的相對豐度與數(shù)量要顯著高于健康樣品。Fusarium是指示健康與發(fā)病香蕉植株根際真菌區(qū)系差異的最主要貢獻(xiàn)者，是發(fā)病香蕉根際真菌區(qū)系的指示類群。Bacillus的相對豐度與Fusarium的相對豐度與數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。根據(jù)以上結(jié)果推測，如果能在香蕉根際增加Bacillus的數(shù)量而降低Fusarium的數(shù)量將有利于防控香

8、蕉枯萎病，Bacillus與Fusarium的比值可以作為監(jiān)測預(yù)警香蕉枯萎病發(fā)生的指標(biāo)。
　　3.將從健康香蕉根際土壤懸液中分離到的細(xì)菌菌落與香蕉枯萎病病原菌FOC進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)，獲得能高效抑制FOC生長的菌株NJN-6。通過構(gòu)建16S rRNA發(fā)育樹以及將菌株NJN-6全基因組測序鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens。菌株NJN-6的全基因組注釋結(jié)果表明該菌株基因組含有一個由11個基因組成的合成pe

9、nicillin的基因簇，擁有43個與脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)的基因，91個與孢子產(chǎn)生和萌發(fā)相關(guān)的基因，是潛在的植物病害的生防菌。通過與菌株B.amyloliquefaciens FZB42的全基因組比較獲得菌株NJN-6基因組中的特異性片段，進(jìn)而設(shè)計得到用于精確定量NJN-6菌株的特異性引物，從而能夠在土壤中定量監(jiān)測菌株NJN-6的動態(tài)變化，進(jìn)一步研究菌株NJN-6在土壤中的存活能力。菌株NJN-6土壤存活能力測試包括兩個處理:1）將菌株發(fā)

10、酵液直接添加到土壤中(IS);2)將菌株發(fā)酵液與有機肥混合后制成微生物有機肥后添加到土壤中(BIO)。研究發(fā)現(xiàn)接種后，7天內(nèi)菌株NJN-6能在土壤中維持相對較高的數(shù)量，15天后數(shù)量驟減，30天后在土壤中的數(shù)量基本維持穩(wěn)定。添加有機肥有利于提高菌株NJN-6在土壤中的存活數(shù)量，減緩其死亡速率，有利于菌株NJN-6在土壤中發(fā)揮生防效果。
　　4.將菌株NJN-6與氨基酸有機肥混合通過二次發(fā)酵制成BIO，并通過BIO營養(yǎng)缽育苗以及田間穴

11、施BIO顯著降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率，生防率達(dá)68％，香蕉產(chǎn)量較對照處理翻了一番。高通量測序的結(jié)果再次證明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對豐度最高的細(xì)菌類群，是健康香蕉根際細(xì)菌區(qū)系的指示類群。發(fā)病香蕉根際土壤中Fusarium的數(shù)量顯著高于健康樣品。Fusarium的數(shù)量與香蕉產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與香蕉枯萎病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Bacillus的相對豐度與Fusarium的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。香蕉植株健康狀況與香蕉根際細(xì)

12、菌微生物區(qū)系具有顯著相關(guān)性，健康香蕉根際細(xì)菌微生物區(qū)系與發(fā)病樣品具有顯著差異。盡管如此，MRT分析表明BIO處理對香蕉根際細(xì)菌微生物區(qū)系的影響大于植株健康狀況對其的影響。BIO在香蕉根際培育了一個以有益微生物(Bacillus spp.)為主導(dǎo)的微生物區(qū)系，降低了FOC在根際的定殖數(shù)量，最終實現(xiàn)了防控香蕉土傳枯萎病的目的。
　　本研究以香蕉枯萎病為例，展示了開發(fā)新型微生物有機肥防控土傳病害的整個過程:1）健康香蕉根際土壤微生物區(qū)系