制備具有生物相容性和機械強度的半月板組織工程支架的實驗研究.pdf

1、因為半月板組織解剖結構的獨特性,所以半月板的損傷是很常見的骨科疾病,而通過外科手術技術很少能真正地重建半月板組織。半月板是纖維軟骨組織,由納米級膠原纖維交錯相連構成半月板結構的基本框架,從微觀上觀察,它又分為三層不同結構,構成每一層結構的膠原纖維有各自排列模式。半月板損傷后,無血液供應部分不能再生,所以研究人員嘗試利用組織工程技術來重建半月板。
　　從目前國內外的研究發(fā)現,尚無一種單一材料和單一的制備技術能制備出具備半月板纖維軟骨

2、組織特征的組織工程支架。應用復合材料的原理和方法,將具有互補特性的兩種或兩種以上材料按一定比例和方式組合,制成兼?zhèn)錂C械強度、可降解性和生物相容性的復合材料,并選擇適宜的制備工藝,可以設計構造出能夠滿足組織工程支架所需的結構和性能優(yōu)化的三維復合材料支架。目前復合材料種類繁多,而天然生物材料與人工合成高分子材料之間的復合,顯現了良好的組織相容性及生物力學特性,適合應用在半月板這種組織構造比較特殊的軟骨組織重建。在本課題中,根據人工合成材料聚

3、乳酸(PLA)具備一定的機械強度,又有彈性,符合半月板的“雙相”特性,我們選用其作為生物材料中的基本成分,為了增加它的可降解性,將它與聚羥基乙酸(PGA)復合,為了改善它的生物相容性,我們又利用天然生物聚合物明膠對它進行表面修飾。同時,考慮到組織工程支架的形貌結構對引導細胞增殖方向,誘導組織形成起到關鍵作用,設計制備的支架就要很好地仿生組織的細胞外基質結構。靜電紡絲技術能夠制備納米級的纖維結構支架,很好地仿生了細胞外基質的膠原纖維結構。

4、根據前期工作,改變接收板材質為銅質,增加一個電場,先行應用靜電紡絲技術制備聚乳酸聚羥基乙酸(PLGA)纖維結構的支架作為支架基底層,仿生半月板組織的細胞外基質纖維結構,再在PLGA纖維結構支架表面紡一層明膠纖維結構支架對PLGA進行表面修飾,制成雙層結構支架,增加PLGA支架的親水性和組織相容性。制備的支架兼具機械強度、可降解性和組織相容性。
　　鑒于靜電紡絲技術制備的支架達到一定厚度后,因高分子材料的絕緣性和電場力的限制,再想提

5、高支架的厚度,有相當大的挑戰(zhàn)。而熱致相分離(TIPS)技術,使三維立體結構支架的厚度得到大大地改觀,改良的梯度熱致相分離技術,又使支架孔隙的排列走向得到控制。我們選用有韌性可降解材料聚3-羥基丁酸酯共聚4-羥基丁酸酯poly(3-hydroxybutyrateo-co-4-hydroxybutyrate),簡稱P(3HB-co-4HB),復合聚乳酸(PLA),改善PLA的降解性,利用梯度熱致相分離技術制備PLA/P(3HB-co-4HB

6、)取向孔隙三維支架,再結合物理吸附作用,將天然生物聚合物明膠涂覆在支架表面,更加改善了支架的生物相容性,使其具備誘導細胞取向增殖,促進組織形成,發(fā)揮組織工程支架的作用。
　　第一部分 靜電紡絲技術制備有機械強度和細胞相容性的雙層納米纖維結構半月板組織工程支架
　　目的:1.利用靜電紡絲技術制備組織工程支架。2.通過明膠纖維的表面修飾提高支架生物相容性。3.評估支架具備適合組織工程支架要求的物理化學性質。
　　方法:在前

7、期工作基礎上,改進靜電紡絲設備,將接收板改用銅質材料,并在接收板上增加一個新的電場,利用“層-層沉積”技術,先紡出一層PLGA纖維結構支架作基底層,再紡制一層明膠(Gelatin)纖維結構在其表面上沉積制備雙層結構支架。同時以純的PLGA和明膠混合PLGA分別各紡出一種纖維支架作為對照組。將三種支架的表征、親水性、降解性和機械強度進行測試比較。
　　結果:Gelatin/PLGA雙層纖維結構支架與另外兩種支架對比,具備直徑合適的納

8、米級纖維、有較大孔徑、較高的孔隙率、較高的親水性、滿意的降解率和良好的機械強度。
　　結論:明膠/PLGA雙層纖維結構支架仿生了半月板組織細胞外基質結構,具備作為組織工程支架的理化特性。
　　第二部分 骨髓間充質干細胞誘導分化的半月板細胞種植支架聯合培養(yǎng)
　　目的:1.提取兔的骨髓間充質干細胞,進行誘導分化為半月板細胞。2.將細胞種植于前面制備的三種不同的纖維結構支架上,在體外進行培養(yǎng)。3.觀察細胞在支架上的形態(tài),通過

9、細胞增殖情況及合成分泌功能的比較分析,評估不同支架的細胞相容性。
　　方法:應用密度梯度離心法提取兔骨髓間充質干細胞,在軟骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng),獲得的纖維軟骨細胞通過表征觀察和特異性染色(H.E、甲苯胺藍、AB-PAS、Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色)進行鑒定。接種細胞于三種不同支架,通過觀察細胞表征、組織染色、增殖測試評估三種不同支架對細胞的相容性及對細胞特性的保持。
　　結果:提取的骨髓間充質干細胞可以誘導分化成半月板纖維軟骨細

10、胞,種植于支架后能夠增殖,并保持纖維軟骨細胞的表征和功能,尤其在明膠/PLGA雙層纖維結構支架上增殖顯著。
　　結論:明膠/PLGA雙層纖維結構支架接種經誘導分化的纖維軟骨細胞的聯合培養(yǎng)為組織工程技術重建半月板提供理論依據。
　　第三部分 制備具有生物相容性和機械強度的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)三維組織工程支架
　　目的:1.改進的梯度熱致相分離技術制備PLA/P(3HB-co-4HB)三維多孔

11、取向支架。2.在支架表面吸附明膠(Gelatin)進行修飾,制備的支架進行表征、親水性、降解性和機械強度的測試評估。3.支架上種植前面獲得的誘導分化的骨髓間充質干細胞,評估支架的細胞相容性。4.與第一部分制備的Gelatin/PLGA雙層纖維結構支架進行機械強度和細胞相容性方面的對比。
　　方法:應用改進的梯度熱致相分離技術制備PLA/P(3HB-co-4HB)三維多孔支架,用物理吸附方法以明膠對支架進行表面修飾,標記為Gelat

12、in/PLA/P(3HB-co-4HB)支架,制備的支架與未經過修飾的PLA/P(3HB-co-4HB)支架進行表征、孔隙率、降解性、親水性和機械力學性能的測試對比后,種植經誘導分化的骨髓間充質干細胞,通過觀察細胞在支架上的生長,及細胞一支架復合體的特異性染色和掃描電鏡、共聚焦顯微鏡觀察情況進行對比分析,評估明膠修飾支架在細胞相容性方面的優(yōu)越性。為了選擇更優(yōu)越的支架,再與第一部分制備的Gelatin/PLGA雙層纖維結構支架進行拉伸強度

13、和細胞種植支架增殖情況的對比。
　　結果:梯度熱致相分離技術制備的三維多孔支架經明膠修飾后,具備較理想的理化性質,種植其上的經誘導分化的骨髓間充質干細胞能夠很好地增殖,并保持纖維軟骨表征。與Gelatin/PLGA雙層纖維結構支架對比,有更強的機械強度和優(yōu)越的細胞相容性。
　　結論:相比Gelatin/PLGA雙層纖維結構支架,明膠修飾的PLA/P(3HB-co-4HB)三維立體結構支架更適于成為半月板組織工程支架。

14、　　第四部分 Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架負載誘導分化的干細胞植入裸鼠體內構建纖維軟骨的實驗研究
　　目的:檢測細胞一支架復合體植入裸鼠皮下構建纖維軟骨組織。
　　方法:首先測試支架的安全性,用支架浸提液進行皮下刺激試驗和急性毒性實驗。然后將前面實驗中已經得到的經示蹤劑染色的誘導分化干細胞負載于支架上構成復合體與單純無細胞支架植入裸鼠皮下,進行培養(yǎng)4周后,在多功能活體成像系統(tǒng)下觀察,確認支架內細胞存

15、活、增殖。將裸鼠處死,取出細胞一支架復合體,制成切片,進行組織染色和免疫組化染色觀察對比。
　　結果:制備的Gelatin/PLA/P(3 HB-co-4HB)支架是有生物相容性的,是安全的。負載誘導分化干細胞的支架植入裸鼠皮下后,可見支架內被標記的細胞增殖明顯,細胞融合,相互聯系,分泌纖維軟骨細胞外基質。在支架環(huán)境中,有半月板纖維軟骨組織形成的趨勢。
　　結論:負載誘導分化干細胞的Gelatin/PLA/P(3 HB-co