16種天然植物化妝品中微生物的分離及研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，化妝品安全問題受到越來越多人們的重視，微生物檢驗(yàn)是化妝品質(zhì)量控制的重要項(xiàng)目之一。天然植物性化妝品，近幾年市場(chǎng)銷售量很大，但我國對(duì)此類天然化妝品中微生物的研究甚少。本文以新疆產(chǎn)薰衣草精油，奧斯曼眼部用品，以及海娜粉系列染發(fā)產(chǎn)品為研究對(duì)象，通過薄膜過濾法排除防腐劑干擾，對(duì)16種天然植物性化妝品樣品中的微生物進(jìn)行分離篩選，微生物通過微孔濾膜過濾后富集，再將濾膜放置于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，根據(jù)濾膜上生長的菌

2、落數(shù)量、菌落形態(tài)，進(jìn)行分類初篩;對(duì)檢出微生物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，經(jīng)過VITEK2生化鑒定系統(tǒng)對(duì)分離出的菌株進(jìn)行鑒定，采用美國Nccls頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)已鑒定致病菌做藥物敏感試驗(yàn);構(gòu)建用于天然植物化妝品中典型致病菌的菌落PCR快速檢測(cè)技術(shù)，并選取三株已鑒定的菌株，依據(jù)特異型基因，設(shè)計(jì)特異性引物，建立多重PCR快速檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)天然植物化妝品中三種致病菌的方法。
　　試驗(yàn)結(jié)果可知16種樣品通過運(yùn)用濾膜法，對(duì)膏霜、乳劑，油狀液體

3、，固體粉狀三類天然植物化妝品分別進(jìn)行膜過濾前稀釋，抑制防腐劑干擾試驗(yàn)，分離篩選出典型菌，結(jié)果較滿意。在卵磷脂-吐溫80上16種樣品菌生長情況可知，膏霜、乳劑狀樣品和油狀樣品的最佳稀釋比為10-3，即10mL供試液，進(jìn)行薄膜過濾后再用含0.1％吐溫80，0.9％生理鹽水(45℃)沖洗薄膜3次，每次100ml;而固體粉狀樣品由于含菌量較大，稀釋比例在10-4時(shí)，菌落生長數(shù)量可計(jì)且單菌落多，即10mL供試液，進(jìn)行薄膜過濾后再用含0.1％吐溫8

4、0，0.9％生理鹽水(45℃)沖洗薄膜4次，每次100ml。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用薄膜過濾法，接種7株代表菌的染菌回收率均高于90％，可見薄膜過濾法能有效去除防腐劑對(duì)含菌檢出率的干擾。
　　對(duì)檢出100株微生物進(jìn)行分離篩選，革蘭氏染色鏡檢，經(jīng)過VITEK2生化鑒定系統(tǒng)鑒定得到37株致病菌:糞大腸桿菌5株，金黃色葡萄球菌1株，銅綠假單胞桿菌3株，肺炎克雷伯氏菌6株，地衣芽孢桿菌10株，陰溝腸桿菌10株，鏈球菌1株，腸球菌1株。6類抗生素

5、藥物與試劑藥敏試驗(yàn)結(jié)果均得到顯著抑菌直徑環(huán)，且各菌株呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，無出現(xiàn)重大錯(cuò)誤判定結(jié)果。
　　針對(duì)分離出的地衣芽孢桿菌RpoB基因、肺炎克雷伯氏菌phoE基因、銅綠假單胞桿菌gyrA基因作為靶基因，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，所建立的三重PCR具有很高的敏感性和特異性，試驗(yàn)通過對(duì)退火溫度、3對(duì)引物、Mg2+、EasyTaq DNA Polymerase等參數(shù)的優(yōu)化，確定三重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。結(jié)果如下:10×Easy T

6、aq Buffer(Mg2+)1.5μ L，2.5 mM dNTPs2.5μ L，10μ MgyrA上下游引物各1.0μ L、10μ MphoE上下游引物各1.0μL、10μMRpoB上下游引物各0.5μL，模板DNA各2μ L，5 U/μL EasyTaqDNA Polymerase0.5μL，ddH2O補(bǔ)足25μL;反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;按照94℃45 s，58℃45 s，72℃60 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7