日本鰻鱺胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分離純化及性質(zhì)分析.pdf

1、簍關(guān)大學(xué)碩士學(xué)位論文日本鰻鱺胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分離純化及性質(zhì)分析PurificationandCharacterizationofTrypsinandChymotrypsinsfromJapaneseeelIAnguillajaponica)專業(yè)名稱：盒晶型堂皇王程論文答辯日期：2Q!量生Q塹旦Q量旦日本鰻鱺胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分離純化及性質(zhì)分析摘要胰蛋白酶(Trypsin，EC34214)和胰凝乳蛋白酶(Chymotryps

2、in，EC34211)屬于絲氨酸蛋白酶家族中的主要水解酶，它們都是肽鏈內(nèi)切酶。胰蛋白酶能特異切割賴氨酸和精氨酸殘基的羧基側(cè)鏈，而胰凝乳蛋白酶可以在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸(芳香族氨基酸)的羧基處切斷肽鍵。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在魚體內(nèi)起著重要的生理和消化功能。工業(yè)生產(chǎn)上，在低溫下仍然具有高活性的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可以作為工具酶應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等行業(yè)。目前，國內(nèi)外關(guān)于魚類胰蛋白酶的報(bào)道很多，但對胰凝乳蛋白酶的報(bào)道卻很少。本文

3、以淡水日本鰻鱺為研究對象，旨在對其重要消化器官肝胰腺中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶進(jìn)行同時(shí)分離純化，并對它們的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為這類酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。通過硫酸銨分級鹽析、DEAESepharose陰離子交換層析，Phenyl—Sepharose疏水層析、SephacrylS200凝膠過濾層析、SP—Sepharose陽離子交換層析等手段分離純化得到胰蛋白酶(陰離子型的胰蛋白酶TrypsinB)和胰凝乳蛋白酶(陽離子型的胰凝乳蛋白酶

4、ChymotrypsinA及陰離子型的胰凝乳蛋白酶ChymotrypsinB)。SDSPAGE、NativePAGE結(jié)果表明TrypsinB和Chymotrypsins都得到高度純化并且都是單體結(jié)構(gòu)。胰蛋白酶B的分子量為215kDa，以BocPheSerArgMCA為底物，胰蛋白酶的最適溫度為40。C，最適pH為85。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明TrypsinB的K，，值為31gmol／L，‰。t值為599(S‘1)，催化效率(‰。。／‰)為193(

5、rtmol／L)oS～。胰凝乳蛋白酶A、B的分子量分別為27kDa和275kDa，以Suc—LeuLeu。Val—Tyr—MCA為底物，胰凝乳蛋白酶A、B的最適溫度分別為40和45。C，最適pH值分別為8和85，動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明胰凝乳蛋白酶的‰值分別為94和91pmol／L，乜。L值分別為18和41(S。)，催化效率(kcat／Km)分別為02和05(pmol／L)。1S～。所純化的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在酸性條件下均不穩(wěn)定，而在堿性條件

6、下穩(wěn)定，二價(jià)金屬離子Cu2，Zn2和Fe2能明顯的抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活力。另外，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、benzamidine、和STI等對所純化的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶起到很強(qiáng)的抑制作用。胰蛋白酶B的N一末端12個(gè)氨基酸序列為IvGGYEcEPHSQ，該序列和來自其它物種的胰蛋白酶的序列有很高同源性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，鰻鱺胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均能與兔抗鯽魚胰蛋白酶多克隆抗體、兔抗鯽魚胰凝乳蛋白酶多克隆抗體呈不同程度的陽