ICOSL-ICOS逆向信號(hào)調(diào)控樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能研究.pdf

1、本課題中,我們利用前期真核表達(dá)的具有生物活性的人ICOSIg融合蛋白和構(gòu)建的膜表達(dá)ICOS的CHO細(xì)胞株,研究ICOS是否向樹突狀細(xì)胞傳遞逆向信號(hào)及該逆向信號(hào)是否可以引起DCs相應(yīng)功能的改變,進(jìn)一步深入探討ICOSL/ICOS通路信號(hào)傳遞的本質(zhì)和內(nèi)在機(jī)制,全面的了解ICOS/ICOSL配受體相互作用對(duì)機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)的重要作用。 研究?jī)?nèi)容： 第一部分,主要研究前期構(gòu)建的人ICOSIg與小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞體外特異性的

2、結(jié)合、驗(yàn)證其生物學(xué)活性、研究可溶性ICOSIg蛋白本身對(duì)DCs的是否具有毒性作用,為后續(xù)研究ICOSIg與DCs表面ICOSL結(jié)合傳遞逆向信號(hào)的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第二部分,主要研究ICOSIg結(jié)合小鼠骨髓體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天不成熟DCs表面ICOSL后,能否引起DCs相應(yīng)的功能變化。檢測(cè)指標(biāo)包括:DCs表型分子的變化、DCs分泌細(xì)胞因子的變化、DCs吞噬功能改變、DCs抗原遞呈功能改變、DCs對(duì)同種異基因T細(xì)胞刺激增殖能力變化

3、。另外還利用體外構(gòu)建的表達(dá)膜錨定ICOS的CHO細(xì)胞株,模擬體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用,對(duì)可溶性ICOSIg蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證。 第三部分,由于研究發(fā)現(xiàn),針對(duì)共刺激分子另一家族成員PD-1配體PD-L2的抗體,作用于成熟DCs,可向DCs傳遞逆向信號(hào),誘導(dǎo)產(chǎn)生了一種兼俱較強(qiáng)抗原攝取和抗原遞呈功能并有成熟DCs表型的新的一類DCs細(xì)胞。我們也擬進(jìn)一步研究ICOSIg作用于成熟過(guò)程中和成熟后的DCs,能否引起DCs的功能改變

4、。 第四部分,由于體外研究缺少體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境因素相互作用的影響,我們借鑒文獻(xiàn)建立皮膚過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型,在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證體外觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討。 實(shí)驗(yàn)方法： 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ICOSIg與其配體的特異性結(jié)合、實(shí)驗(yàn)處理后各DCs或T細(xì)胞表面分子的變化、胞內(nèi)細(xì)胞因子變化、DCs的吞噬功能等；采用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)各種培養(yǎng)上清中和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞因子、趨化因子、表面分子

5、的表達(dá)變化；采用Annexin V/PI復(fù)染檢測(cè)不同因素處理后細(xì)胞凋亡的變化；采用CCK-8檢測(cè)可溶性蛋白對(duì)DCs細(xì)胞的毒性和促增殖作用；采用3H-TdR摻入檢測(cè)DCs細(xì)胞抗原遞呈功能和刺激異基因T細(xì)胞增殖能力；采用WesternBlot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)p38總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)情況；采用小鼠皮膚過(guò)敏反應(yīng)的模型,體內(nèi)驗(yàn)證ICOSIg的生物學(xué)功能。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一部分,研究結(jié)果表明,體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCs表面,有一定

6、程度的ICOSL的表達(dá),且ICOSL的表達(dá)隨DCs細(xì)胞的成熟而逐漸下調(diào)。為了驗(yàn)證體外表達(dá)可溶性人ICOSIg與小鼠DCs特異性結(jié)合,我們先將DCs用CD16/32封閉,然后與ICOSIg或人IgG共孵育,再加入熒光標(biāo)記抗人IgG二抗,可檢測(cè)到ICOSIg與DC的結(jié)合,而對(duì)照IgG與DC無(wú)結(jié)合；為進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)合的特異性,我們用不同濃度的ICOSIg與PE標(biāo)記的抗鼠ICOSL抗體同時(shí)作用于DC,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗ICOSL抗體與DC結(jié)合受到不同程

7、度的阻斷；如果先加入ICOSIg與DC共孵育,則ICOSIg可完全阻斷抗鼠ICOSL抗體與DC的結(jié)合。同時(shí)借助于Annexin v/PI染色和CCK-8試劑盒,我們也發(fā)現(xiàn)ICOSIg處理過(guò)程中,DCs死亡或凋亡情況與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化。同時(shí),人源ICOSIg可在體外抑制不同品系小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),更表明其具有生物學(xué)活性。 第二部分,我們首先用可溶性ICOS蛋白與骨髓單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源DCs(5天,未成熟)共孵育

8、,檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1表達(dá)。其中IL-2、IL-4低于試劑盒檢測(cè)下限,ICOSIg不改變DCs分泌IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1細(xì)胞因子的表達(dá)變化；而DCs表達(dá)IL-6水平隨融合蛋白ICOSIg濃度的增加而明顯上調(diào)。定量RT-PCR表明各實(shí)驗(yàn)組DCs表達(dá)TGF-β1,PGE2,CCL3,CCL4和CCL19無(wú)明顯差異,

9、但I(xiàn)COSIg處理組IL-10有部分升高。與此同時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明ICOS處理組DCs表達(dá)共刺激分子CD83、CD80、CD86和Iab表達(dá)均比對(duì)照組有相應(yīng)的提高,而ICOSL低于對(duì)照。進(jìn)一步定量RT-PCR檢測(cè)ICOSL mRNA水平結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照蛋白組ICOSL表達(dá)無(wú)明顯差異。 第三部分,研究表明PD-L2的抗體可以向成熟DCs傳遞逆向信號(hào),而我們及其他研究者均發(fā)現(xiàn)DCs成熟過(guò)程當(dāng)中,ICOSL的表達(dá)量逐漸下調(diào)。

10、那么ICOS能否向成熟過(guò)程中和成熟后的DCs傳遞逆向信號(hào)調(diào)節(jié)DCs的功能狀態(tài)?我們?cè)贗COSIg處理DCs的同時(shí)加入100ng/mL LPS或者是在加入100ng/mL LPS處理24h誘導(dǎo)DCs成熟后,再用ICOSIg處理DC24 h。結(jié)果LPS單獨(dú)處理組DC分泌各種細(xì)胞細(xì)胞因子,除IL-2、IL-4,均比無(wú)LPS處理組明顯升高,其表面分子的表達(dá)也明顯增加,高于未刺激不成熟DCs。與對(duì)照組IgG相比,ICOSIg加LPS處理組DCs分

11、泌TGF-β1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,IL-10、IL-12 P40、IL-12 P70、TNF-α、IFN-γ等均無(wú)明顯差別。ICOSIg+LPS組DC細(xì)胞各表面分子的表達(dá)也低于或類似于對(duì)照組。 第四部分,為了進(jìn)一步在體內(nèi)確證ICOSIg引起的DCs功能變化,我們采用皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)研究ICOSIg作用后的DCs調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的變化。用ICOSIg處理DCs,再用p815AB多肽和5μM破傷風(fēng)毒素(tetanus toxin,tt

12、)多肽沖擊后,經(jīng)尾靜脈輸入不同分組小鼠。2周后,誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。結(jié)果表明：(1)無(wú)處理和對(duì)照IgG1蛋白處理不成熟DCs體外經(jīng)p815AB和tt刺激后,能引起輕度足墊皮膚過(guò)敏反應(yīng)；而經(jīng)過(guò)ICOSIg處理后,DCs能夠誘發(fā)出明顯的過(guò)敏反應(yīng),實(shí)驗(yàn)鼠左足重量明顯增加；(2)若ICOSIg處理DCs細(xì)胞前先用足量抗ICOSL抗體封閉,則ICOSIg處理足墊過(guò)敏反應(yīng)程度顯著下調(diào)；(3)若在DCs與ICOSIg或IgG1孵育時(shí)加入抗IL-6阻斷性抗體

13、,則ICOSIg處理也不能引起典型足墊過(guò)敏反應(yīng)。如在ICOSIg處理DCs的同時(shí),加入LPS刺激,再進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),則各實(shí)驗(yàn)組DCs細(xì)胞均可誘發(fā)出明顯的過(guò)敏反應(yīng),但對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異。抑制DCs中p38-MAPK通路進(jìn)而抑制IL-6的分泌后,DCs誘導(dǎo)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的能力下調(diào)。 討論： 共刺激分子家族成員配受體之間存在正反向信號(hào)的現(xiàn)象比較普遍。我們?cè)诒菊n題中致力于研究ICOS/ICOSL通路是否同樣存在反向信號(hào),并對(duì)

14、該信號(hào)的性質(zhì)作深入的探討。以往研究用計(jì)算機(jī)模擬的方式,證明人和小鼠的ICOS結(jié)構(gòu)相似,ICOS與配體ICOSL結(jié)合面關(guān)鍵氨基酸的序列也高度相似；我們的研究表明真核表達(dá)的人ICOSIg確實(shí)可以和小鼠DCs細(xì)胞表面ICOSL發(fā)生特異性結(jié)合,并具有生物學(xué)活性。進(jìn)一步研究表明可溶性ICOSIg可以向不成熟DC傳遞逆向信號(hào),引起骨髓來(lái)源不成熟DCs特異性分泌IL-6增加,同時(shí)DCs表型分子CD83、CD80、CD86和Iab表達(dá)均高于相應(yīng)對(duì)照組。

15、ICOS處理不成熟DCs后其吞噬和抗原遞呈功能均增強(qiáng),引起Th1細(xì)胞比例和功能增加,可在體內(nèi)促進(jìn)DCs調(diào)節(jié)的細(xì)胞免疫。然而,我們也發(fā)現(xiàn)如果在ICOSIg作用DCs過(guò)程中加入LPS或CpG誘導(dǎo)DCs成熟,則DCs分泌TGF-β1升高。由于LPS等因素刺激DCs成熟后,DCs分泌大量的促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-12、TNFα、IL-1β等,因此,盡管ICOS可以引起TGF-β1的部分增加,但其抑制免疫反應(yīng)的功能作用有限,在體外僅引起DC

16、s部分功能的改變,在體內(nèi)則不能檢測(cè)到明顯的功能差異。然而也存在另外一種可能,因?yàn)镮COS僅在DCs成熟過(guò)程中促進(jìn)其表達(dá)TGF-β1,而我們是在使用LPS和ICOSIg作用完畢后,收集細(xì)胞輸注小鼠體內(nèi),此時(shí),細(xì)胞已基本處于成熟狀態(tài),不同實(shí)驗(yàn)處理引起的DCs功能差異己接近消失,在這種情況下,皮膚過(guò)敏反應(yīng)的模型可能并不能夠真實(shí)反應(yīng)DCs功能的改變,可能需要更好的模型來(lái)檢測(cè)相關(guān)的功能變化。 通過(guò)本課題的研究,我們首次證明和其他部分共刺激

17、分子一樣,ICOS/ICOSL通路也存在反向信號(hào)；然而不同的是,隨著環(huán)境因素的不同,ICOS可以通過(guò)同樣的配體ICOSL傳遞不同的免疫信號(hào)：向不成熟DCs傳遞免疫刺激信號(hào),誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生,增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)；向成熟過(guò)程中的DCs傳遞免疫抑制信號(hào),誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá),調(diào)節(jié)成熟過(guò)程中DCs細(xì)胞的功能狀態(tài)。以往研究表明同一個(gè)配體可以通過(guò)不同受體傳遞不同信號(hào),如PD-1通過(guò)其配體PD-L1和PD-L2可傳遞不同的信號(hào)；不同的配體也可以經(jīng)過(guò)同

18、一個(gè)受體傳遞不同的信號(hào),如CCL19和CCL21結(jié)合CCR7、CD28/CTLA-4結(jié)合CD80/CD86;然而,像ICOS/ICOSL這種同一個(gè)配體通過(guò)同一個(gè)受體傳遞不同信號(hào)的方式卻是首次證實(shí),這也更表明免疫系統(tǒng)、免疫細(xì)胞之間相互影響、相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。因此,ICOS可以通過(guò)DCs表面的ICOSL向不同成熟狀態(tài)的DCs傳遞不同的信號(hào),調(diào)節(jié)機(jī)體在不同狀態(tài)下的免疫應(yīng)答,這為進(jìn)一步闡明ICOS/ICOSL通路在機(jī)體免疫調(diào)控中的作用以及針