人源蛋白CAP的串聯(lián)SH3結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架蛋白vinculin相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、人源蛋白CAP(又稱為Ponsin)，屬于vinexin蛋白家族，是一個重要的參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的接頭蛋白。在功能方面，CAP對細(xì)胞粘著斑(focal adhesion)的形成及其動態(tài)變化的調(diào)控有重要的意義。而CAP與細(xì)胞骨架蛋白vinculin的相互作用對CAP在粘著斑處的細(xì)胞定位和它的功能的正常行使是必不可少的。但是目前CAP和vinculin相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不太清楚。
　　Vinexin家族蛋白的結(jié)構(gòu)組成高度保守，它們在N

2、末端都有一個SoHo結(jié)構(gòu)域，而C末端包括三個串聯(lián)的SH3結(jié)構(gòu)域。另一方面，Vinculin是一個由1066個氨基酸組成的細(xì)胞骨架接頭蛋白，它是由D1，D2，D3，D4，D5五個結(jié)構(gòu)域組成，其中D1-D4結(jié)構(gòu)域組成vinculin的頭部，而D5結(jié)構(gòu)域被看作vinculin的尾部結(jié)構(gòu)域。Vinculin的頭部結(jié)構(gòu)域和尾部結(jié)構(gòu)域之間通過一段富含脯氨酸的柔性區(qū)域連接。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CAP的C末端的第一個和第二個SH3結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與vinculin

3、的富含脯氨酸的柔性區(qū)域結(jié)合。
　　我們利用核磁共振波譜學(xué)技術(shù)解析了CAP的第一個和第二個SH3串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，我們通過ITC和化學(xué)位移擾動實(shí)驗(yàn)找到了CAP在vinculin上確切的結(jié)合位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)CAP的SH3串聯(lián)結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镉胁煌倪x擇特異性。CAP結(jié)合vinculin的時候是兩個SH3結(jié)構(gòu)域同時結(jié)合到vinculin的富含脯氨酸的序列。我們同時解析了兩個SH3結(jié)構(gòu)域分別與各自底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)分析找

4、到了決定兩個SH3結(jié)構(gòu)域viculin結(jié)合選擇特異性的關(guān)鍵殘基，Q807SH3a和D881 SH3b，通過對這兩個位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)殘基突變進(jìn)一步驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　我們通過核磁共振NOE實(shí)驗(yàn)，核磁主鏈弛豫實(shí)驗(yàn)和殘留偶極耦合(RDC)實(shí)驗(yàn)對串聯(lián)SH3結(jié)構(gòu)域在自由狀態(tài)和結(jié)合底物狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化和動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)SH3結(jié)構(gòu)域在自由狀態(tài)下兩個結(jié)構(gòu)域之間不存在任何結(jié)構(gòu)域間相互作用，而在底物結(jié)合狀態(tài)下，雖然在底物束縛下兩

5、個結(jié)構(gòu)域變得更加收斂但是仍然沒有固定的相對取向。
　　在功能上，vinculin存在從自抑制狀態(tài)到激活的過程，該過程涉及vinculin結(jié)構(gòu)上頭部和尾部之間較大尺度的構(gòu)想變化。為了了解CAP對vinculin的激活的影響，我們迸一步利用小角散射、電鏡實(shí)驗(yàn)、和分子動力學(xué)模擬技術(shù)得到了CAP與vinculin全長蛋白的復(fù)合物分子模型，并且分析了可能存在的構(gòu)象變化。我們也通過超速離心共沉淀實(shí)驗(yàn)來檢測CAP是否可以幫助vinculin結(jié)合