楊樹(shù)與潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）互作中的細(xì)胞生物學(xué)、活性氧代謝及細(xì)胞過(guò)敏性反應(yīng).pdf

1、植物．病原菌互作過(guò)程中，受侵寄主細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列與植物抗病性相關(guān)的反應(yīng)，其中包括植物細(xì)胞對(duì)病原菌的識(shí)別、胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)換與傳導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)的開(kāi)啟、活性氧的爆發(fā)、系統(tǒng)獲得抗性(system acquired resistant，SAR)的形成等，這些反應(yīng)在時(shí)間和空間上與寄主組織和細(xì)胞水平上的結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞壞死及病原菌受抑制等有密切關(guān)系。相關(guān)研究在農(nóng)作物上已取得了許多有意義的成果，但在林木上對(duì)寄主．病原菌互作的過(guò)程和機(jī)理了解得還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

2、 本論文以楊樹(shù)．潰瘍病菌互作為研究系統(tǒng)，以毛白楊(Populus tomentosa Carr．)、北京楊(P.beijingensis Hsu)為研究對(duì)象，以愈傷組織、離體枝條和盆栽苗為試驗(yàn)材料，應(yīng)用電子顯微、熒光顯微、分子細(xì)胞學(xué)、生理生化等技術(shù)和方法，研究了楊樹(shù)與潰瘍病菌互作過(guò)程中細(xì)胞膜透性(細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率)、可溶性糖含量、丙二醛、活性氧(O<'-><,2>和H<,2>O<,2>)、抗氧化酶(SOD、CAT、POD、APX)的產(chǎn)生

3、和積累，分析了這些變化在抗病和感病楊樹(shù)之間的差異；觀察了潰瘍病菌侵染過(guò)程中寄主細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，分析了水分脅迫對(duì)寄主超微結(jié)構(gòu)的影響及與病害發(fā)生的關(guān)系；對(duì)過(guò)氧化物酶進(jìn)行了細(xì)胞化學(xué)定位，探討了過(guò)氧化物酶在植物抗病過(guò)程中的分布及作用；采用電鏡、熒光染色、DNA Ladder等方法初步研究了楊樹(shù)．潰瘍病菌互作中細(xì)胞的過(guò)敏性反應(yīng)，力爭(zhēng)從多個(gè)角度揭示楊樹(shù)與潰瘍病菌的互作機(jī)制。主要研究結(jié)果如下： 1．對(duì)毛白楊和北京楊愈傷組織接種潰瘍病菌(Bo

4、tryosphaeria dothidea)后，測(cè)定了細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖及MDA含量。結(jié)果顯示：潰瘍病菌侵染后，2種楊樹(shù)愈傷組織細(xì)胞膜透性上升，相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，北京楊上升幅度大于毛白楊；可溶性糖含量的變化在2種楊樹(shù)間變化差異較大，北京楊可溶性糖含量呈上升趨勢(shì)，在24 h和120 h時(shí)達(dá)到高峰，毛白楊可溶性糖含量在48 h時(shí)略高于對(duì)照，為24.96μg·g<'-1>FW，比相應(yīng)對(duì)照增加的幅度只有11.43％，其余測(cè)定時(shí)間則低于對(duì)

5、照，方差分析表明毛白楊處理與對(duì)照相比可溶性糖含量差異不顯著(P=0.295)；感病品種MDA含量上升，而毛白楊MDA含量變化不明顯，說(shuō)明感病楊樹(shù)出現(xiàn)了膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象。 2．在溫室模擬干旱脅迫試驗(yàn)條件下，以1年生毛白楊和北京楊扦插苗為試驗(yàn)材料，設(shè)置正常水分、中度脅迫和重度脅迫3個(gè)處理，并對(duì)盆栽苗干部接種潰瘍病菌，接種后繼續(xù)進(jìn)行干旱脅迫，研究了干旱與潰瘍病菌共同作用下，楊樹(shù)干部潰瘍病害發(fā)生及與樹(shù)皮超微結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系特征。結(jié)果顯示

6、：(1)隨著干旱脅迫程度的增加，2種楊樹(shù)潰瘍病害發(fā)生漸趨嚴(yán)重；(2)干旱脅迫下，楊樹(shù)樹(shù)皮組織細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，并隨脅迫程度的增加而嚴(yán)重；(3)干旱脅迫下接種病原菌，2種楊樹(shù)細(xì)胞發(fā)生不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞器發(fā)生較大變化，如出現(xiàn)葉綠體腫脹變形、線粒體數(shù)量增多，質(zhì)膜模糊不清等現(xiàn)象；隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞器受到進(jìn)一步損傷，葉綠體被膜折皺，嚴(yán)重時(shí)局部破裂，基質(zhì)外滲，并部分最終解體；(4)毛白楊中的菌絲主要在細(xì)胞間隙中穿行，而北京楊的菌絲除

7、在細(xì)胞間隙中生長(zhǎng)之外，侵入細(xì)胞內(nèi)部也較多，直接導(dǎo)致細(xì)胞的解體；(5)干旱脅迫下細(xì)胞的損傷促進(jìn)了病原菌的侵染，干旱和病原菌的雙重脅迫加劇了病害的發(fā)生程度，并且病原菌侵染對(duì)細(xì)胞的破壞程度大于水分脅迫。干旱和潰瘍病菌共同作用對(duì)于寄主有促進(jìn)病害發(fā)生和加重病情的作用。 3．對(duì)過(guò)氧化物酶的細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論抗病楊樹(shù)還是感病楊樹(shù)，接種后均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中有過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，毛白楊過(guò)氧化物酶的活性不僅明顯高于未接種的對(duì)照，也明顯

8、高于接種處理后的北京楊，并且定位更廣泛，在細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙、葉綠體膜、線粒體膜及液泡膜上均有大量定位，而北京楊酶反應(yīng)產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞壁上，在細(xì)胞膜、核膜局部有少量定位，定位范圍及強(qiáng)度均小于毛白楊。毛白楊過(guò)氧化物酶產(chǎn)生早，積累量大，北京楊過(guò)氧化物酶的積累量明顯低于毛白楊。 4．測(cè)定了接種潰瘍病菌(Botryosphaeria dothidea)后2種楊樹(shù)(Populus spp．)樹(shù)皮中O<'-><,2>、H<,2>O<,2>、

9、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)及膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的動(dòng)態(tài)變化，分析了楊樹(shù)與潰瘍病菌互作中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生、抗氧化酶活性及膜脂過(guò)氧化水平的變化規(guī)律及與楊樹(shù)抗病性的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)，2種楊樹(shù)O<'-><,2>產(chǎn)生速率和H<,2>O<,2>含量均有上升趨勢(shì)，毛白楊出現(xiàn)了較明顯的“氧化爆發(fā)”，

10、北京楊則不明顯；POD活性持續(xù)上升，毛白楊上升幅度大于北京楊；SOD、CAT活性先上升后下降，北京楊2種酶活性在后期受到的抑制更明顯；APX活性則在2種楊樹(shù)中變化較大，毛白楊明顯比北京楊變幅大；MDA含量增加，表明“氧化爆發(fā)”啟動(dòng)了膜脂過(guò)氧化，北京楊在后期MDA含量大幅上升，并且MDA含量與O<'-><,2>產(chǎn)生速率呈顯著正相關(guān)。 5．對(duì)潰瘍病菌侵染后不同時(shí)間的楊樹(shù)愈傷組織進(jìn)行DAPI特異性染色，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)接菌后2

11、4 h，毛白楊部分細(xì)胞核表現(xiàn)染色質(zhì)的不均一，核質(zhì)濃縮并“趨邊化”，呈棒形或彎月形，但大多數(shù)細(xì)胞核仍為近圓形；接菌48 h后，大多數(shù)細(xì)胞核形狀開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則，染色質(zhì)的不均一化更加明顯，并有部分細(xì)胞核DNA發(fā)生斷裂；接菌后72 h，在胞間發(fā)現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)，但分枝較少；接菌后144 h，在胞間發(fā)現(xiàn)菌絲有較多分枝，分枝侵入相鄰細(xì)胞，這時(shí)候周?chē)募?xì)胞核已很少有熒光現(xiàn)象，細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化。北京楊接菌48 h即發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間有菌絲生長(zhǎng)，72 h時(shí)細(xì)胞間生長(zhǎng)的菌

12、絲已很多，并且菌絲分枝也較多，周?chē)募?xì)胞均已空泡化，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的染色質(zhì)凝集。對(duì)枝條病斑交界處的樹(shù)皮組織提取DNA，經(jīng)1.6％瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，毛白楊接種后第5 d和6 d出現(xiàn)明顯的DNALadder現(xiàn)象，而北京楊沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象；但2種楊樹(shù)均未出現(xiàn)系統(tǒng)性的細(xì)胞過(guò)敏性反應(yīng)，其產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。對(duì)接菌后不同時(shí)間的楊樹(shù)愈傷組織DNA進(jìn)行電泳，2種楊樹(shù)均未出現(xiàn)DNA Ladder現(xiàn)象，但在48 h～96 h有比較明顯的DNA拖尾彌散，結(jié)