豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行病學(xué)研究及Nsp7β保守氨基酸對病毒增殖的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus，PRRSV)引起的病毒性傳染病。PRRS給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV不斷地突變和重組，致使多種變異毒株在各地流行傳播。此外，PRRSV具有十分獨特而復(fù)雜的免疫學(xué)特性，其致病機理也未完全揭示。因此對PRRS的控制并未取得實質(zhì)性成效。本文將從PRRSV

2、的流行變異情況和Nsp7β保守位點對病毒增殖的影響兩部分進行探究，為PRRS的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
　　(1)PRRSV流行病學(xué)研究
　　為了研究中國中部地區(qū)PRRSV的流行變異情況，擴增并分析了31份ORF5基因和18份Nsp2基因的高度變異區(qū)?；谌LORF5核酸序列進行遺傳系統(tǒng)進化分析，其中18株分離株屬于NADC30-like毒株，11株分離株屬于高致病性毒株(HP-PRRSVs)。同源性分析結(jié)果顯示，NADC30-

3、like PRRSVs分離株彼此間核酸序列同源性為91.71％-99.34％，HP-PRRSVs分離株彼此的同源性為98.84％-99.67％。氨基酸(aa)序列比對結(jié)果顯示，HP-PRRSVs分離株幾乎沒有新氨基酸突變，但NADC30-like毒株則含有大量新氨基酸突變，尤其是GP5蛋白的誘騙表位、糖基化位點等重要基序區(qū)域。值得注意的是，NADC30-like分離株HNhx含有S32H、N33D、D34N和S36G氨基酸變異，導(dǎo)致其丟

4、失了aa30-35區(qū)段所有的糖基化位點。為了進一步的了解當前流行的NADC30-like毒株的特性，分離了特殊變異株HNhx。全基因組測序與重組分析結(jié)果顯示，HNhx毒株由NADC30毒株與高致病性毒株的疫苗毒株JXA1-P80重組而來，重組區(qū)域為Nsp4(nt5，261)-Nsp9(nt7，911)。以上結(jié)果表明，HP-PRRSVs依然在中部地區(qū)廣泛傳播，而NADC30-like毒株則逐漸開始流行;HP-PRRSV毒株相對趨于保守，N

5、ADC30-like毒株則經(jīng)歷了快速變異和演化過程。
　　(2)Nsp7β保守位點的作用
　　對46株GenotypeⅡ型PRRSV毒株全基因組氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)雖然Nsp7β具有一定的變異性，但在所有PRRSV毒株中都存在一段21aa(aa30-50)的保守序列。進一步與動脈炎病毒屬中的其它成員比較發(fā)現(xiàn)，aa38位點在整個動脈炎病毒科中都相對保守。為了研究Nsp7β保守區(qū)域和位點對Nsp7β功能的影響，以HP-PRR

6、SV毒株HN07-1為親本毒株建立了PRRSV反向遺傳操作平臺。首先對HN07-1毒株進行了全基因組測序和分析，將全長基因組分4段構(gòu)建到改造后的pCDNA3.1(+)載體中。同時也構(gòu)建了在ORF1b和ORF2間插入EGFP的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建完成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PRRSV易感細胞Marc145，并進行盲傳，盲傳一代后，細胞出現(xiàn)了PRRSV感染典型的細胞病變效應(yīng)，Western blot和IFA試驗結(jié)果表明病毒拯救成功。將重組毒株分別命名為rHN