絲素蛋白無紡網(wǎng)的生物相容性及構(gòu)建組織工程化軟骨的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：絲素蛋白無紡網(wǎng)的生物相容性研究
　　 目的：以家蠶絲為原料制備出制備絲素蛋白無紡網(wǎng)(non-woven silk fibroinnet，NWSFN)支架，并對(duì)其進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)。
　　 方法：通過簡(jiǎn)單的方法將家蠶絲制成絲素蛋白無紡網(wǎng)支架，并進(jìn)行掃描電鏡觀察其形態(tài)。根據(jù)ISO 10993、國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886和文獻(xiàn)資料對(duì)該支架材料進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)：①急性全身毒性實(shí)驗(yàn)：

2、實(shí)驗(yàn)組小鼠按50ml/kg 劑量經(jīng)腹腔注射材料生理鹽水浸提液，對(duì)照組以同樣劑量經(jīng)腹腔注射生理鹽水，注射后4h、24h、48h、72h 觀察和記錄小鼠狀態(tài)、中毒癥狀和死亡數(shù)目以了解其對(duì)全身的影響；②體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：采用噻唑藍(lán)(MTT)法計(jì)算HeLa細(xì)胞相對(duì)增值率(RGR)來評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性；③植入后短期局部反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：將支架材料和不可吸收縫線分別植入小鼠左右側(cè)背部皮下，分別于1周、2周、3周、4周后取材進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE 染色，觀

3、察其引起的組織反應(yīng)。
　　 結(jié)果：①材料形態(tài)特征：制備好的材料成白色片狀，電鏡顯示其成三維網(wǎng)狀，無絲膠及其他雜質(zhì)殘留，絲素蛋白纖維的平均直徑約9～15μm；②急性全身毒性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組小鼠一般狀況良好，無急性全身毒性癥狀；③體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：材料的毒性評(píng)級(jí)為0～Ⅰ級(jí)，屬無毒范疇；④短期植入后局部反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：植入后材料周圍炎性反應(yīng)輕微且局限。
　　 結(jié)論：絲素蛋白無紡網(wǎng)具有良好的生物相容性，有可能成為理想的天然組織工程支架材料

4、。
　　 第二部分：以絲素蛋白無紡網(wǎng)為支架體外構(gòu)建組織工程化軟骨
　　 目的：探討以絲素蛋白無紡網(wǎng)(non-woven silk fibroin net，NWSFN)作為耳廓軟骨細(xì)胞外支架體外構(gòu)建組織工程化軟骨的可行性。
　　 方法：取成年新西蘭兔耳廓軟骨，酶消化法獲取軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后取原代細(xì)胞接種到制備好的絲素蛋白無紡網(wǎng)支架上，體外復(fù)合培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞粘附、生長、增殖情況。于復(fù)合培養(yǎng)后第3、7

5、、10 天時(shí)取材進(jìn)行掃描電鏡觀察，于復(fù)合培養(yǎng)第1、2、4、6周取材進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)和通過RT-PCR方法檢測(cè)復(fù)合物上軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：復(fù)合培養(yǎng)24h 后大部分軟骨細(xì)胞已粘附于絲素蛋白纖維上，72h 后細(xì)胞開始分泌少量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，且細(xì)胞-支架復(fù)合物透光度降低；電鏡下觀察顯示軟骨細(xì)胞及分泌的薄層細(xì)胞外基質(zhì)主要分布于支架材料淺層，支架內(nèi)部細(xì)胞及基質(zhì)甚少。