防治地黃連作障礙有益細菌生物學特性及大田定殖能力的研究.pdf

1、地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）連作障礙是阻礙地黃產(chǎn)量增加的主要原因之一，尋找克服地黃連作障礙的方法是目前中藥學研究的熱點課題之一。研究認為地黃連作導致根際微生物區(qū)系失衡是連作障礙發(fā)生的主要原因之一。本研究對克服地黃連作障礙的有益菌株活性及大田定殖能力進行研究，主要目的是利用有益菌株克服地黃連作障礙。
　　利用菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化試驗對實驗室前期研究得到的對克服地黃連作障礙的有益菌株：1~10

2、號菌進行傳統(tǒng)方法的鑒定；并利用分子生物學手段，將菌株16SrDNA序列經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast比對后，結合傳統(tǒng)鑒定結果，最終鑒定1~10號菌株分別為：1、6、9號菌為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），2號菌為短黃桿菌（Myroides odoratimimus），3號菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）4號菌為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）5號為嗜冷桿菌（Psychroba

3、cter alimentarius），7、10號菌為球形節(jié)桿菌（Arthrobacter aurescens.），8號菌為普通變形菌（Proteus vulgaris）。
　　為了方便菌種的保藏及滿足菌種開發(fā)的要求，對各菌株生長的最適培養(yǎng)基、pH值、溫度、搖床轉速及保藏條件進行了研究，研究結果表明：適合在 LB培養(yǎng)基中生長的為2、3、5、7、9、10號菌；適合在NB培養(yǎng)基中生長的為1、4、6、8號菌；適合在pH值為7的條件下生長的

4、為1、3、4、10號菌；適合在pH值為8的條件下生長的為2、5、6、7、8、9號菌；適合在28℃條件下生長的為1、2、3、6、8、9、10號菌；適合在30℃條件下生長的為4、7號菌；適合在25℃條件下生長的為5號菌；適合斜面?zhèn)鞔２氐木N為1、3、6號菌；適合斜面保藏的菌株為2、7、9、10號菌；適合液體甘油法保藏的菌株為1、3、4、5、6、7、8、9、10號菌；適合穿刺保藏的菌株為2號菌；適合砂土管保藏的菌株為2、4、5、8號菌；適合

5、超低溫冷凍保藏的菌株為1、3、4、5、6、7、8、9、10號菌。
　　MS培養(yǎng)基中添加生地提取液可以使地黃苗死亡，用1~10號菌分別對組培苗進行浸根處理后，地黃苗都能夠成活，但是各菌株作用效果有差異，比較各菌處理的地黃組培苗生長速度及植株長勢，其中9號菌作用效果最明顯，因此選擇9號菌作為施入大田的有益菌株，根據(jù)其假單胞菌的特性，利用三親本雜交法對其進行 Lux發(fā)光酶基因標記，標記成功的菌株命名為 C-9號菌，比較標記前后菌株的生理

6、生化等性質及標記前后菌株對地黃組培苗的作用效果，差異不顯著(P>0.05)。
　　將C-9號菌施入無菌栽培的地黃盆栽苗根部，每隔5天取樣觀察C-9號菌在盆栽中的定殖，發(fā)現(xiàn)其在盆栽中連續(xù)存在95天左右；將C-9號菌培養(yǎng)液施入大田后，每隔5天取樣觀察，發(fā)現(xiàn)其在大田條件下能夠存在55天左右，且施入大田后，前期土壤中細菌、真菌數(shù)量都顯著增多(P<0.05)，放線菌數(shù)量顯著減少了；后期隨著土壤中C-9號菌數(shù)量的減少(P<0.05)，細菌、真