基于生物芯片標記技術的五種瀕危冷杉保護遺傳學研究.pdf

1、冷杉屬（Abies）是松科中的第二大屬，全世界約有50種，是組成寒溫性暗針葉林和亞高山暗針葉林的建群樹種，它們組成了高山地區(qū)獨特的森林景觀，在涵養(yǎng)水源、保護河川上游水資源方面起著重要作用，是各分布區(qū)高山造林和森林更新的重要樹種；由于該屬樹種耐寒、耐蔭性強，喜氣候涼潤，主要分布于北半球的高海拔或高緯度地區(qū)，在我國的東南部很難見到。1976年以來相繼在我國浙江、廣西、湖南、貴州和江西五省區(qū)發(fā)現5種冷杉新種，百山祖冷杉(A.besganzue

2、nsis)（吳鳴翔定名發(fā)表）、元寶山冷杉(A.yuanpaoshanensis)（呂庸浚和傅立國定名發(fā)表）、資源冷杉(A.ziyuanensis)（傅立國和莫新禮定名發(fā)表）、梵凈山冷杉(A.fanjinshanensis)（黃威廉定名發(fā)表）和大院冷杉(A.dayuanensis)（劉起銜定名發(fā)表）。這5種冷杉植物的發(fā)現否定了以往亞熱帶的低、中山無冷杉分布的觀點，被認為是植物地理學和植物學上的一大發(fā)現。這幾種冷杉野生群體數量稀少，全部被列

3、為國家一級重點保護植物。目前這幾種冷杉分類存在爭議，保護策略缺乏科學依據，而且部分材料野生植株極其稀少，如百山祖冷杉野生群體只剩3株。在樣本很少情況下，要開展物種分類和保護遺傳學研究只能尋求能大幅度提高檢測位點數的方法才能提高實驗可信度。生物芯片技術具有高通量、高效率的特點，可以達到此目的。本論文利用生物芯片技術的手段，開展了遺傳標記生物芯片的制作與檢測研究，并將該技術應用于5種瀕危冷杉的保護遺傳學研究，分析了5種冷杉的分子親源關系和群

4、體遺傳分化，探討了它們的瀕危原因和保護策略，并對冷杉的水培繁殖作了研究，主要結論如下：
　　1.生物芯片技術對模板DNA的質量要求較高,而冷杉葉片中含有大量的多糖、蛋白質、多酚和色素類等次生代謝物質。本試驗采用改良的CTAB法提取了冷杉基因組DNA，有效地去除了各種影響實驗結果的雜質。檢測結果表明，提取的DNA樣品的D260 nm/D280 nm比值都為1.9左右，均為白色絮狀沉淀,溶液清亮,無黏稠感,純度較好。在芯片工作緩沖液中

5、檢測表明，提取的DNA樣品孔均不發(fā)亮,且DNA主帶清晰,無彌散帶，能適應生物芯片的工作緩沖液環(huán)境，完全滿足生物芯片技術對DNA質量的要求。
　　2.實驗以小麥、云杉、為對照，研究了冷杉基因組DN A復雜性，將三種材料基因組DNA酶切后，采用不同的選擇性堿基的引物擴增。結果表明冷杉基因組DNA復雜性高于小麥和云杉，提示冷杉基因組DNA復雜性降低須采取更有效措施；采用PstⅠ和TaqⅠ兩種酶切組合得到的片段數過多，提示應采用更多種的酶

6、切組合或選擇性堿基引物擴增可降低冷杉基因組DNA復雜性；冷杉基因組含C、G堿基數可能多于含A、T堿基數，提示應選用相對富含CG多的限制性內切酶可能有利于酶切效果。
　　3.實驗采用7種不同的限制性內切酶組合酶切冷杉基因組DNA后，采用有無選擇性堿基的PstⅠ引物擴增酶切片段，探討適合冷杉基因組DNA復雜性降低的方法。結果表明酶切組合PstⅠ+TaqⅠ+MseⅠ酶切片段在無選擇性堿基引物擴增時片段分布在750bp左右，分子量比較大的

7、片段相對較少，分布比較均勻集中，從該酶切組合的+3堿基引物擴增時顯示沒有明顯的條帶，說明該酶切組合效果最好；酶切組合PstⅠ+BstNⅠ、PstⅠ+TaqⅠ效果次之，其它幾種酶切組合不甚理想。
　　4.實驗采用PstⅠ+TaqⅠ+MseⅠ酶切組合酶切冷杉基因組DNA樣品構建基因組DNA文庫，并用所得文庫點制冷杉基因組DNA芯片，再用同樣酶切方法進行樣品處理后與芯片雜交，檢測各芯片質量參數。檢測結果表明芯片樣點基本比率、中值比率和均

8、數比率相關系數均大于0.9，參考通道信噪比為79.017-92.024，雜交后檢測通道信噪比為20.786-32.827，說明采用該方法得到的芯片質量比較好，可以用于構建冷杉基因組DNA芯片。
　　5.實驗利用6種冷杉的基因組DNA為建庫材料，研究了冷杉基因組DNA芯片的制作方法，芯片質量參數和有效標記參數的選取，以及不同文庫構建方法和不同樣品處理方法對有效標記得率的影響，研究結果表明：綜合分析后認為實驗應選取重復性100％，召回

9、率大于85%標記點比較合適，此時得到的平均有效標記得率為18%左右，不同方法制作的芯片文庫具有一定通用性，有效標記得率具有一定偏好性，芯片文庫構建方法和樣品處理方法相同時有效標記產率最高。
　　6.實驗采用PstⅠ、TaqⅠ和M seⅠ3種限制性內切酶混合酶切5種冷杉基因組DNA，并用酶切后的DNA片段制作遺傳多樣性檢測的芯片檢測并分析了5鐘冷杉群體內遺傳多樣性，分析的遺傳多樣性參數有多態(tài)位點百分率、觀察等位基因數、有效等位基因數

10、、Nei基因雜合度、Shannon多樣性指數等，并對結果做了差異顯著性分析和多重比較，結果顯示，5種冷杉的遺傳多樣性排序順序為：資源冷杉﹥元寶山冷杉﹥梵凈山冷杉﹥大院冷杉﹥百山祖冷杉5種冷杉，資源冷杉和元寶山冷杉差異不顯著，大院冷杉和百山祖冷杉差異不顯著，元寶山冷杉和梵凈山冷杉差異不顯著，其它兩兩間差異極顯著。（具體參數值見第7章列表）
　　7.實驗采用PstⅠ、TaqⅠ和M seⅠ3種限制性內切酶混合酶切5種冷杉基因組DNA，并

11、用酶切后的DNA片段制作遺傳多樣性檢測的芯片檢測并分析了5鐘冷杉群體間遺傳分化，并計算了群體間遺傳距離，利用遺傳距離估算了群體分化時間，結果顯示，5種冷杉群體209個位點平均的總基因多樣度 Ht=0.2608±0.0004,平均的群體內基因多樣度Hs=0.1653±0.0004;群體間基因分化系數Gst=0.3664；群體間基因流Nm=0.8647。5種冷杉中資源冷杉、元寶山冷杉、大院冷杉三種冷杉間親源關系最接近，這三種冷杉和百山祖冷杉

12、關系比較接近，梵凈山冷杉與以上4種冷杉關系最遠。資源冷杉、元寶山冷杉、大院冷杉相互間分化時間最短，在4.5千年-9.9千年之間。分化時間最長的是梵凈山冷杉和百山祖冷杉之間，為54千年。
　　8.試驗采用了水培方式研究了在水培條件下生根調節(jié)劑和營養(yǎng)液對冷杉水培生根過程中愈傷誘導、生根率、最長根長、平均根長等參數的影響。結果表明生根調節(jié)劑（ABT和IAA）對誘導百山祖冷杉水培愈傷誘導、生根率、生根數有明顯作用，兩者都適合在百山祖冷杉水

13、培繁殖中應用。但激素處理對最長根長和平均根長無規(guī)律性影響。營養(yǎng)處理對百山祖冷杉水培繁殖前期各項均無影響，但在出根后會影響根的生長。冷杉水培試驗研究冷杉繁育提供了新的思路，有望使冷杉脫離瀕?，F狀，使該物種作為水培盆景進入尋常百姓的生活，對于物種多樣性保護，具有重要的意義。
　　9.末次冰期以來氣候變暖使南方冷杉分布區(qū)極度縮小是冷杉瀕危的直接原因；人為砍伐和對冷杉生境的破壞是冷杉瀕危的重要原因；工業(yè)廢氣對環(huán)境的污染間接影響冷杉生境；冷