RAPD及SSR方法對(duì)HFJ和MIJ近交系大鼠的遺傳特性分析.pdf

1、目的:大鼠是藥物開發(fā)和人類疾病研究最重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一,近交系大鼠更有其不可替代的應(yīng)用價(jià)值。目前,世界上培育成功的近交系大鼠已有1000種左右,但是,我國(guó)使用的近交系大鼠全部是從國(guó)外引進(jìn)的。本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的技術(shù)人員從2001年6月開始培育近交系大鼠,從屏障環(huán)境飼養(yǎng)的Wistar大鼠中選擇雌雄1對(duì),作為起始親代,連續(xù)近親交配繁殖,初步形成HFJ和MIJ兩個(gè)不同特點(diǎn)的近交系。
　　 初步觀察,HFJ品系大鼠繁殖性能和后代發(fā)育性能

2、明顯高于其他品系大鼠,甚至高于遠(yuǎn)交群大鼠。經(jīng)送國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)中心檢測(cè)該品系已經(jīng)符合近交系動(dòng)物遺傳標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)一步開發(fā)研究,即可建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品系。MIJ品系大鼠表現(xiàn)為后代雄性出現(xiàn)小睪丸和生殖系統(tǒng)自發(fā)腫瘤,初步觀察為常染色體單基因隱性遺傳,進(jìn)一步開發(fā)可培育出自發(fā)雄性不育和生殖系統(tǒng)腫瘤動(dòng)物模型,作為人類疾病研究和新藥開發(fā)的重要實(shí)驗(yàn)材料,填補(bǔ)世界自發(fā)雄性不育品系大鼠的空白。
　　 在近交系動(dòng)物的繁殖和飼養(yǎng)中由于飼養(yǎng)

3、管理不當(dāng)和人為失誤或動(dòng)物自身的遺傳變異等,造成近交系遺傳特征發(fā)生改變,出現(xiàn)遺傳污染或基因突變,如果不能將變異的大鼠及時(shí)剔除,將會(huì)影響到整個(gè)大鼠群的遺傳特性。如果在科學(xué)研究中被采用,將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或可靠性降低甚至得出錯(cuò)誤的結(jié)論。因此,對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格、有效的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè),保證其遺傳穩(wěn)定性十分必要。
　　 現(xiàn)行哺乳動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法中,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)生化標(biāo)記和免疫學(xué)標(biāo)記法做出相應(yīng)規(guī)定,但以上方法檢測(cè)的都不是遺傳物質(zhì)本身,而外在的表現(xiàn)是

4、基因和環(huán)境綜合作用的結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際并不完全一致。比如BALB/c小鼠與其突變系BALB/c-nu-nu,用生化標(biāo)記分析是無法區(qū)分這兩種動(dòng)物的。
　　 分子生物學(xué)檢測(cè)方法以動(dòng)物基因組DNA為檢測(cè)材料,DNA的差異是一種生物與另一種生物的本質(zhì)區(qū)別。因此,分子生物學(xué)檢測(cè)方法不會(huì)像以表型為檢測(cè)材料的傳統(tǒng)方法那樣受到環(huán)境的影響。而且同傳統(tǒng)生化標(biāo)記和免疫學(xué)標(biāo)記相比,具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感等優(yōu)勢(shì)。
　　 RAPD和SSR是上世

5、紀(jì)90年代發(fā)展起來的分子生物學(xué)研究方法,在目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳研究應(yīng)用的分子生物學(xué)方法中是比較常用的兩種,現(xiàn)在已廣泛用于遺傳作圖,動(dòng)物的品系鑒別,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳多樣性及穩(wěn)定性研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯肦APD和SSR方法對(duì)HFJ和MIJ兩個(gè)近交系大鼠進(jìn)行遺傳分析,建立兩大鼠的RAPD和SSR特征性遺傳圖譜,作為該品系動(dòng)物遺傳檢測(cè)的參考。
　　 方法:
　　 1基因組DNA的提取:用傳統(tǒng)酚-氯仿法和自動(dòng)核酸提取儀提取

6、4個(gè)品系HFJ(F23)、MIJ(F21)、F344和Lewis人鼠基因組DNA。
　　 2 RAPD技術(shù)對(duì)四個(gè)近交系大鼠進(jìn)行遺傳研究:選擇60條隨機(jī)引物,對(duì)HFJ(F23)、MIJ(F21)、Lewis大鼠、F344大鼠基因組擴(kuò)增,經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)四個(gè)品系的遺傳多樣性。
　　 3 SSR方法對(duì)近交系大鼠進(jìn)行遺傳研究:根據(jù)大鼠基因組數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)選擇24個(gè)SSR位點(diǎn)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電

7、泳,經(jīng)過銀染顯色照相,比較四個(gè)品系大鼠之間的多態(tài)性,對(duì)HFJ、MIJ大鼠遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1 RAPD方法對(duì)四個(gè)品系的大鼠基因組進(jìn)行擴(kuò)增,總共60條引物,其中有12條引物能在四個(gè)品系均擴(kuò)出清晰的條帶,用引物C-19擴(kuò)增,電泳圖中可見Lewis大鼠和F344大鼠在1000bp處多出現(xiàn)一條明顯的條帶,HFJ(F23)和MIJ(F21)大鼠均無此條帶;引物M-10擴(kuò)增中,F344大鼠1000bp處擴(kuò)增出條帶

8、,其他品系大鼠則沒有。M-4引物擴(kuò)增中,僅F344雌性大鼠1000bp處擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多態(tài)性條帶,M-5引物擴(kuò)增,僅F344雌性大鼠1000bp和小于500bp處擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,其他大鼠則沒有。使用選定的15條引物擴(kuò)增結(jié)果顯示,HFJ和MIJ大鼠之間均表現(xiàn)相同的擴(kuò)增圖譜。
　　 2四個(gè)品系大鼠HFJ、MIJ、Lewis、F344均在24個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,其中HFJ、MIJ大鼠之間除D6Mit1、D6Mit5、D10w

9、ox12引物擴(kuò)增產(chǎn)物外其他大小無差別;HFJ、MIJ兩品系同Lewis和F344近交系分別在11個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小有差異,其中與Lewis不同的位點(diǎn)包括D1Rat345,D3wox9,D3Wox6,D4Arb10,D5Hmgc2,D7Mit19,D8Rat14,D8Mit7,D11Mgh3,D11Wox3,D12Mit2,與F344不同的位點(diǎn)包括D1Rat345,D4Arb10,D5Hmgc2,D7Mgh3,D7Mit19,D8M

10、it7,D9Mit2,D10Wox12,D10Mgh22,D11Mgh3,D11Wox3;Lewis同F(xiàn)344之間在9個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小有差異,包括D3Wox9,D3Wox6,D7Mgh3,D8Rat14,D9Mit2,D10Wox12,D10Mgh22,D10Mgh3,D12Mit2。
　　 HFJ(F23)在D6Mit1、D10Wox12位點(diǎn)處,出現(xiàn)品系內(nèi)條帶差異,D6Mit1擴(kuò)增圖中HFJ(F23)雄性擴(kuò)增片段比雌性

11、擴(kuò)增片段稍大,D10Wox12擴(kuò)增圖中HFJ(F23)雌雄均呈雜合。用11只HFJ(F26)大鼠重復(fù)以上實(shí)驗(yàn),擴(kuò)增圖譜的條帶均一致,末發(fā)現(xiàn)品系內(nèi)差異。
　　 MIJ(F21)在D6Mit5、D10Wox12位點(diǎn)處,出現(xiàn)品系內(nèi)條帶差異,兩位點(diǎn)擴(kuò)增圖中MIJ(F21)雌性呈雜合,對(duì)重新選取的9只MU(F23)雄性大鼠重復(fù)以上實(shí)驗(yàn),擴(kuò)增圖中9只MIJ(F23)譜條帶一致。
　　 結(jié)論:
　　 1用篩選的12條隨機(jī)引物建

12、立起HFJ和MIJ近交系大鼠的特征性RAPD圖譜,兩近交系圖譜完全一致,但與Lewis和F344均存在顯著的不同。
　　 2用24個(gè)SSR位點(diǎn)建立起HFJ和MIJ兩近交系大鼠的特征性SSR圖譜,兩近交系非常相似,但與Lewis和F344存在姓著差別。實(shí)驗(yàn)中曾發(fā)現(xiàn)在HFJ和MIJ存在品系內(nèi)的差異,但是,在以后的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中未得到驗(yàn)證。
　　 3由于HFJ和MIJ共同起源于同一對(duì)Wistar大鼠,因此基因組極為相似,而同Le