熒光多參量顯微技術研究.pdf

1、熒光光譜技術和熒光顯微技術已經(jīng)發(fā)展成為生物醫(yī)學領域的強大工具。將熒光光譜學參數(shù)和熒光顯微測量相結合既提供了高度的分子結構特異性和微環(huán)境變化信息，又提供了高的空間分辨率。生物醫(yī)學發(fā)展對檢測和成像系統(tǒng)的一個要求是在一次測量中能以很高的靈敏度和特異性得到多種功能信息。熒光光譜測量可以鑒別不同的熒光團種類；熒光壽命測量可以對熒光分子所處微環(huán)境的pH值、離子濃度(Ca2+、Na+等)、氧壓等生理生化參數(shù)進行定量分析，而且對于鑒別光譜嚴重重疊的多組

2、分熒光團非常有用。因此，同時光譜和時間分辨可以提供不同的對比機制和互補的功能信息，引起了人們的廣泛關注。生物醫(yī)學發(fā)展對檢測和成像系統(tǒng)的另一個要求是能夠無損、實時監(jiān)測活體細胞的動態(tài)過程。多焦點多光子顯微術(MMM)可以實現(xiàn)樣品的三維快速多光子激發(fā)熒光顯微成像，并具有對活體樣品損傷小，成像深度大，圖像信噪比高等優(yōu)點。目前已經(jīng)實現(xiàn)了MMM與熒光壽命測量相結合的快速成像，但時間分辨率不夠高，更為突出的問題是不能給出光譜分辨信息。針對這些難以解決

3、的問題，本論文主要完成了以下幾方面的研究工作： 1.進一步闡明了與本課題密切相關的熒光顯微術的理論與技術問題。 2.提出了一種兩維空間同時光譜分辨技術，并討論了兩維離散點獲得最佳光譜分辨率的方法。該技術實現(xiàn)了在一個面陣探測器上同時記錄兩維空間的光譜圖像，掃描效率隨激發(fā)點數(shù)線性提高。利用它可同時獲得樣品的熒光光譜和二次諧波圖像。 3.參與設計和研制了一臺重復頻率達到1MHz、可用于兩維空間探測的皮秒同步掃描相機，發(fā)

4、展了基于掃描相機的時間分辨單／雙光子激發(fā)熒光光譜技術，可同時獲取樣品的熒光光譜信息和壽命信息，并對掃描相機的掃描速度、時間分辨率及非線性等進行了標定。 4.實現(xiàn)了一種基于同步掃描相機的兩維空間同時光譜和時間分辨技術，把所獲得的離散點的時問分辨光譜圖像看作是在兩維空間的取樣值，通過對樣品的三維精密微位移，即可獲得五維熒光多參量顯微功能圖像。 5．建立和標定了基于同步掃描相機的時間分辨雙光子激發(fā)熒光光譜測量(tr-TPEFS

5、)系統(tǒng)，通過對標準熒光染料及其混合溶液、熒光生物分子的時間分辨熒光光譜測量對系統(tǒng)進行了測試，獲得了一種解決組織中多熒光團或多組分熒光參數(shù)分離的有效方法，并利用該系統(tǒng)測量了生物樣品的時問分辨自體熒光光譜特性。 6.建立和標定了同時光譜和時間分辨多焦點多光子顯微(SSTR-MMM)系統(tǒng)，進行了同時光譜和時間分辨采樣成像原理實驗，演示了SSTR-MMM系統(tǒng)的五維熒光顯微成像功能，并初步探索了該技術在生物組織成像及疾病診斷中的應用。利用