小麥孢囊線蟲病的生防微生物鑒定及球孢白僵菌08F04菌株對土壤微生物多樣性的影響.pdf

1、小麥禾谷孢囊線蟲（Cereal Cyst Nematode，CCN）在我國的危害日益嚴(yán)重，但是目前生產(chǎn)上主推的小麥品種普遍抗性較差，沒有高效低毒的化學(xué)殺線劑，休耕及輪作等農(nóng)業(yè)措施在我國難以實施，亟需一種經(jīng)濟(jì)有效的防治方法。生物防治是通過天敵生物控制線蟲的數(shù)量或者減輕線蟲的危害程度，不會打破生態(tài)平衡，也不會引起線蟲產(chǎn)生抗性，為防控植物寄生線蟲病害提供了一條新思路。生防菌株的的作用效果取決于施用菌劑的生態(tài)環(huán)境條件和發(fā)生線蟲的種類。因此，篩選

2、出適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的生防菌株，追蹤菌株在土壤中的定殖情況，并通過研究外源施入生防菌對土壤中土著微生物菌群的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響對生防菌株進(jìn)行風(fēng)險評估，對生防菌劑的合理開發(fā)和使用具有重要的指導(dǎo)意義。鑒于此，本文主要包括以下研究內(nèi)容：
　?。?）小麥孢囊線蟲生防菌株的鑒定及防效測定。課題組前期篩選出四株對小麥孢囊線蟲病有較好防治效果的生防菌株，本文通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生理生化方法對其進(jìn)行種類鑒定，生防真菌08F04菌株被鑒定為球

3、孢白僵菌（Beauveria bassiana），生防細(xì)菌細(xì)菌09B18菌株被鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus），生防細(xì)菌09X01菌株被鑒定為木糖氧化無色菌（Achromobacter xylosoxidans），生防放線菌S07菌株被鑒定為環(huán)狀鏈霉菌（Streptomyces anulatus），四種生防菌在小麥孢囊線蟲病的生物防治中均是首先發(fā)現(xiàn)和報道。室內(nèi)盆栽試驗發(fā)現(xiàn)08F04麥粒砂處理、S07麥粒砂處理，細(xì)菌0

4、9B18和09X01拌種處理在溫室條件下對菲利普孢囊線蟲都具有較好的防治效果，孢囊減退率都能達(dá)到50％以上。進(jìn)一步在許昌和鄭州小麥孢囊線蟲重發(fā)地塊進(jìn)行了連續(xù)兩年的田間防效試驗，發(fā)現(xiàn)08F04麥粒砂處理和S07麥粒砂處理對小麥孢囊線蟲的田間防治效果的穩(wěn)定性高于細(xì)菌09B18和09X01拌種處理，孢囊減退率都達(dá)到40%以上。并且08F04麥粒砂處理和S07麥粒砂處理對小麥的鮮重具有較好的促進(jìn)作用和明顯的增產(chǎn)作用。以上結(jié)果說明08F04菌株和

5、S07菌株對小麥孢囊線蟲病的防效比較穩(wěn)定且對小麥植株相對安全，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。因為真菌08F04菌株具有易培養(yǎng)，生長速度快的優(yōu)點，所以篩選出08F04菌株進(jìn)行后續(xù)研究。
　?。?）球孢白僵菌08F04菌株在土壤中的定殖規(guī)律。通過實時熒光定量PCR和稀釋平板計數(shù)監(jiān)測sgfp和hph雙基因標(biāo)記的球孢白僵菌株08F04菌株轉(zhuǎn)化子在室內(nèi)盆栽中的消長規(guī)律，研究08F04菌株在土壤中的定殖情況。首先，對球孢白僵菌株08F04菌株進(jìn)行農(nóng)

6、桿菌遺傳轉(zhuǎn)化，將含有sgfp和hph基因的真菌表達(dá)載體pCAM-gfp轉(zhuǎn)入08F04菌株中，通過PCR和southern雜交驗證綠色熒光蛋白基因sgfp的表達(dá)元件已經(jīng)穩(wěn)定的整合到了球孢白僵菌株08F04的基因組中且為單拷貝，最終獲得了能夠穩(wěn)定遺傳，菌落形態(tài)、生長速度以及寄生能力與野生菌株一致的轉(zhuǎn)化子G10。
　　構(gòu)建G10轉(zhuǎn)化子的實時熒光定量PCR檢測體系，然后通過室內(nèi)盆栽試驗測定接種G10菌株0-6周后每克土壤中sgfp基因的拷

7、貝數(shù)，并通過稀釋涂板法調(diào)查含潮霉素的平板上的菌落數(shù)（CFU），結(jié)果顯示，土壤中sgfp基因的拷貝數(shù)和平板上的菌落數(shù)的變化趨勢一致，且呈一定的線性關(guān)系，擬合方程為y=0.398+0.91x（R2=0.7995，y-基因拷貝數(shù)，x-平板上生長的菌落數(shù)）。08F04菌株的生物量在土壤中呈先增加后減少的趨勢，接種后第3周其在土壤中的定殖量達(dá)到最大（3.8×105copies/g）。所以，為了獲得最優(yōu)的防治效果，可以在播種后第3周補施生防菌。

8、r>　?。?）球孢白僵菌08F04菌株對土壤微生物多樣性的的影響。為了研究球孢白僵菌08F04菌株對小麥不同生育期的根際土壤中微生物多樣性的影響，利用第二代高通量測序技術(shù)分別測定了鄭州和許昌病田中施入08F04菌株后，土著真菌菌群和細(xì)菌菌群的變化情況。結(jié)果顯示，外源施用08F04菌株對土壤中真菌的物種總數(shù)沒有顯著影響，雖然前期對土壤真菌的多樣性有一定的抑制作用，但是后期處理樣品中微生物的多樣性恢復(fù)到了正常水平。而外源生防菌株08F04的

9、施用對土壤中細(xì)菌菌群的物種數(shù)和多樣性都沒有顯著影響。另外PCA結(jié)果顯示，小麥不同生育期對微生物多樣性的影響大于生防菌株的施用對其的影響。
　　高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌株08F04菌株對鄭州和許昌兩地土壤中角擔(dān)菌（Ceratobasidium）和鏈格孢（Alternaria）的豐度有明顯的減少作用，角擔(dān)菌（Ceratobasidium）是小麥紋枯病病原菌立枯絲核菌的有性態(tài)，鏈格孢（Alternaria）是引起小麥黑胚病和葉枯病的

10、病原菌，由此可以推測，球孢白僵菌株08F04菌株在防治小麥孢囊線蟲病的同時，還能夠抑制多種小麥真菌病害的發(fā)生。另外，施用球孢白僵菌株08F04菌株增加了土壤中粘帚霉屬（Clonostachys）的豐度，而粘帚霉屬（Clonostachys）是植物寄生線蟲的一種重要生防菌，在土壤中可能會與球孢白僵菌株08F04菌株協(xié)同抑制小麥孢囊線蟲病的發(fā)生與危害。
　　以上結(jié)果說明球孢白僵菌株08F04菌株對土壤微生態(tài)環(huán)境是相對安全的，投入自然環(huán)