2015年--遺傳學實驗文獻翻譯 --脂連接寡聚糖翻轉酶的結構與催化機制（譯文）

1、<p><b>　　中文6260字</b></p><p>　　出處：Perez C, Gerber S, Boilevin J, et al. Structure and mechanism of an active lipid-linked oligosaccharide flippase[J]. Nature, 2015,524(7566):433-438.</p>

2、;<p>　　脂連接寡聚糖翻轉酶的結構與催化機制</p><p>　　鑲嵌在膜中的脂類具有較大的極性頭部基團，它們的翻轉過程是緩慢的，并且極為不利的。因此，這一過程需要翻轉酶來催化，但其催化機制卻是未知的。一個關于翻轉反應的著名例子是可在蛋白質的N-連接糖基化作為供體的脂連接寡聚糖的轉位。在空腸彎曲桿菌中，這一過程是由一種ABC轉運體——PglK催化的?；诓煌瑺顟B(tài)下的晶體結構，我們在此提出一個由P

3、glK催化的脂連接寡聚糖的翻轉機制。在體外，PglK能夠運用內部和外部的構象，但是只有外部的構象才是催化翻轉反應所需要的。 當脂連接寡聚糖鏈的焦磷酸-寡聚糖鏈頭部基團進入了轉位腔后，會與周邊肽鏈上的正電荷發(fā)生相互作用；而脂質的多聚異戊二烯尾則結合并激活該轉運體，但在翻轉過程中，它仍位于脂雙層中。我們所提出這種機制與適用于其他轉運體的經(jīng)典交替通路模型是有本質區(qū)別的。</p><p>　　脂質從膜的一側轉至另一側，被

4、稱為翻轉，這不僅是維持膜的不對稱性所必須的，而且也是許多生化過程的基礎，比如說，信號傳輸、分泌和細胞內吞中的囊泡形成、膜蛋白活性的調節(jié)和蛋白質天冬氨酰殘基的糖基化。在動物中，脂質雙分子層兩側的不對稱性影響著許多活動，比如說凝血作用、巨噬細胞識別過程和細胞凋亡。在細菌中，細胞壁成分的前體物質被耦聯(lián)在脂質載體中，隨著脂質的翻轉而運出細胞外，這對細胞壁的形成來說是極其重要的。翻轉反應是由主動的，或者說活躍的轉運體蛋白所催化。這些蛋白包括通過消

5、耗能量使得脂質在雙分子層隨機分布的爬行酶（scramblases），由H+或Na+驅動的對向運輸載體，和由ATP驅動的定向轉運特定脂質的轉運體。后者包括P4-ATPases和ABC轉運體。</p><p>　　盡管有了廣泛的研究，但關于由翻轉酶催化的脂質快速翻轉反應的過程和機制仍然知之甚少。直到現(xiàn)在，只有細菌翻轉酶的核心——MsbA蛋白的晶體結構被報導公布出來，但是根據(jù)這點資料無法推斷出任何相關機制。除了缺乏結構

6、方面的資料外，可用于天然底物翻轉反應研究的可靠體外試驗分析也太稀少。</p><p>　　原核生物翻轉酶的一種主要底物是Man5GlcNAc2-PP-dolichol，一種脂連接寡聚糖（LLO），它可以從內質網(wǎng)膜的胞質一側轉移至網(wǎng)腔一側，然后寡聚糖鏈被轉移到新合成肽鏈的天冬氨酸殘基上，從而形成蛋白質的N-連接糖基化。在同源細菌的N-連接糖基化途徑中，一種化學結構類似的LLO（GlcGalNAc5Bac-PP-un

7、decaprenyl）在人類致病菌——空腸彎曲菌中出現(xiàn)了翻轉。作為該過程的催化酶，PglK是一種同二聚體的ABC轉運體，并且在細菌蛋白質N-連接糖基化過程中是必不可少的。在寡聚糖鏈轉移酶PglB作用下，已翻轉的LLO的寡聚糖鏈部分被轉移到受體蛋白質上；而十一異戊二烯焦磷酸鹽部分然后在十一異戊二烯焦磷酸酶的催化下水解為單磷酸鹽。</p><p>　　為了探明由ATP驅動的LLO翻轉反應的機制，我們研發(fā)出了體外分析方

8、法，并測定出了空腸彎曲菌的PglK在不同狀態(tài)下的晶體結構。我們的研究結構揭示了這樣一種機制：只有PglK的外部構象與翻轉反應有關，從而在允許寡聚糖鏈穿過轉運蛋白的情況下，而附著在PglK表面的多聚異戊二烯尾仍然部分嵌在脂雙層中。這一新提出的機制與用于解釋目前研究的大多數(shù)轉運蛋白催化機制的交替通路模型迥然不同。</p><p>　　體外實驗中PglK催化LLO翻轉和ATP水解的活性</p><p

9、>　　人們之前已經(jīng)采用放射性同位素標記的天然脂質來研究多聚異戊二烯連接的寡聚糖的翻轉過程。然而我們發(fā)現(xiàn)PglK無論是在體外還是在體內，都可以催化寡聚糖鏈有所縮短的LLOs。于是，我們再重組PglK和一種糖鏈部分為三糖的LLOs（tLLO），得到了一種蛋白脂質體。這種蛋白脂質體（Fig.1a ）有一個還原末端和兩個N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）部分。此外，還使用了純化的糖基轉移酶PglH

10、。這種酶在空腸彎曲菌中的N-連接糖基化過程有著重要作用，它可以使tLLO的非還原端最多加上三個GalNAc殘基。我們借此來對位于蛋白脂質體外層可被翻轉的tLLO進行放射性標記，以便可以準確測定由ATP驅動的、依賴于PglK的tLLO翻轉反應的速率。我們通過使用足量的UDP-GalNAc，來確保每一個tLLO分子均被加上了三個GalNAc分子，以便能準確測定tLLO是否翻轉到蛋白脂質體的內部（Fig. 1b )。通過用純化的寡聚糖鏈轉移酶

11、PglB把結果中得到的寡聚糖鏈轉移到熒光標記的受體多肽上，然后再進行SBS-PAGE分析，從而證實了tLLO轉變?yōu)榱荓LO這一過程</p><p>　　不同狀態(tài)下PglK的結構</p><p>　　我們測定了分辨率從2.9Å到5.9Å內的PglK突變型E510Q的三種晶體結構（Fig. 2a）。其中兩種是這種載脂蛋白的高分辨率結構圖，并顯示出了內部構象（分別編名為ap

12、o-inward-1和apo-inward-2）；而第三種是結合了ADP的PglK的，這是一種全新的、胞外閉合（outward-occluded）構象。鑒于后者有限的分辨率，我們在建模時借助了一個先前的發(fā)現(xiàn)——ABC轉運體跨膜部分的螺旋在發(fā)生構象改變時總是成對變化的。此外，我們還通過收集有關晶體和硒代半胱氨酸衍生物的反常衍射（anomalous diffraction）數(shù)據(jù)來證實所建立的模型。</p><p>　

13、　PglK的折疊方式和其他ABC轉運體相似，正如細菌ABC轉運體Sav1866的結構所顯示的那樣。然而，PglK含有一個額外的短α-螺旋（稱之為螺旋“EH”）。EH處于細胞膜中，并與膜平面相平行（見下）。我們使用十二烷基麥芽糖新戊二醇（LMNG）作為去垢劑，得到PglK的晶體，從而獲得apo-inward-1和胞外閉合結構；而apo-inward-2則是使用十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）作為去垢劑而獲得的。三種晶體結構之間的聯(lián)系是

14、顯著的，正如結晶情況所顯示的那樣。本項發(fā)現(xiàn)揭示去垢劑的種類和格子聯(lián)系，而非蛋白質固有的性質，決定了內部構象中的核苷酸結合結構域（NBD）的分離程度。但相反的是，在對幾種ABC轉運體的核苷酸結合結構和數(shù)種分離的ABC結構域的觀察中發(fā)現(xiàn)，在胞外閉合狀態(tài)下的NBD排列酷似“封閉的兩層三明治”。這三種PglK結構之間的比較表明主要的構象變化包含了一種類似于剪刀樣的運動，也就是說，跨膜螺旋TM4和TM5一起朝TM6運動，二者傾斜16°（

15、apo-inward-1 vs apo-inward-2）或者是50°（apo-inward-1 vs outward-occlud</p><p>　　外部螺旋EH在PglK-LLO相互作用中的作用</p><p>　　連結PglK的跨膜螺旋TM1和TM2的環(huán)包含外部螺旋EH（Figs 2a and 3a)。而它的周邊（與跨膜區(qū)域相關）由數(shù)個疏水作用、親水作用和陽離子-π確定（

16、Fig.3a）。其結果就是，在靠近膜外邊緣的地方，形成了兩個疏水的溝——分別位于EH和TM1、TM2之間（Fig.3a）。鑒于它不尋常的位置和表面，我們通過研究體內外的PglK突變來探尋EH之間的功能聯(lián)系。我們產(chǎn)生了一個缺失突變（稱為△EH），△EH的整個螺旋（殘基S46-P67）都被一段由八個氨基酸殘基構成的靈活連接體所取代。此外，還產(chǎn)生了一個原有的Tyr殘基為Ala殘基所取代的三突變體（Y50A/Y56A/Y63A，稱為EHm1），

17、和一個涉及穩(wěn)定性的帶正電荷的氨基酸殘基突變的二突變體（R53A/K55A，稱為EHm2）。當重組成脂質體后，這三種EH突變體表現(xiàn)出了和野生型一樣的基礎ATP酶活性。然而，LLO無法激活其ATP酶活性，這說明三種突變體已經(jīng)失去了EH所具有的作用——連結LLO，從而激活ATP酶活性（Fig.3b）。在去垢劑中，EHm1和EHm2的基礎ATP酶活性高于野生型的；然而△EH的則略低于野生型的。然而值得注意</p><p>

18、;　　據(jù)我們推測，在EH附近形成的疏水溝（Fig.3a）也許有助于LLO結合到PglK上。這樣的一種相互作用可能會錨定LLO的脂質尾部，有利焦磷酸部分的定位，從而以便其進入轉運穴之中，進而引發(fā)整個翻轉過程。因為無法測定PglK結合LLO時的結構，我們用人工合成的化合物代替結構上被截短了的天然LLO（Fig.3e）。值得注意的是，截短了的LLOs都無法激活整合到蛋白脂質體中的PglK的ATP酶活性。這也就說明了，縮短了的多聚異戊二烯尾（在

19、geranyl-geranyl-PP-GlcNac中，最多為20個碳原子）也許會阻礙它們?yōu)槲挥谥p層中的PglK所識別。相反的是，當在去垢劑中時，PglK的ATP酶活性可以被法尼基焦磷酸（FPP）、farnesyl-PP-GlcNAc和geranyl-geranyl-PP-GlcNac所激活。和在脂雙層不同的是，在去垢劑中PglK的ATP酶活性激活可能是因為同時結合了多個截短了的LLO分子。泛醌，一種具有和天然LLO相似的多聚異戊二烯尾

20、、而頭部完全不同的分子（Fig. 3e），無論是在去垢劑中，還是在脂質體中，均無法激活PglK的ATP酶活性。這顯示，多聚異戊</p><p>　　內部穴和外部穴的功能</p><p>　　PglK結構的內面有一個比較大的穴，它面朝細胞質，并且通到了脂雙層的內面（Fig.4a）。在其他無核苷酸結合、面向內部狀態(tài)時ABC轉運體中也發(fā)現(xiàn)了相似的穴，它們被認為是底物結合部位。于是，也許有人會推測

21、，在LLO翻轉過程中，由55個碳原子構成的多聚異戊二烯尾從脂雙層中折疊（或者說“卷曲”）進入了疏水的內部穴中（Fig. 4a）。盡管這難以與EH協(xié)助LLO相互作用中的必要屬性相一致，但我們還是探討了這一假想，并且在PglK的每個亞單位中（S294F/V297W）各插入了兩個大的氨基酸殘基，從而使得內部的疏水穴的體積減少了大約60%。這種突變體無論在體外還是體內，都保持著和野生型一樣的翻轉速率和ATP酶激活特性。這也就反駁了內部的穴參與多

22、聚異戊二烯結合過程，并說明多聚異戊二烯尾在翻轉過程中仍然是保持在時脂雙層中。</p><p>　　我們接下來考慮是否是焦磷酸-寡聚糖鏈頭部基團在翻轉過程中被轉運到了內部的穴。然而，這似乎是極其不可能的，原因是：作為ABC轉運體功能區(qū)切換的結果，PglK每個亞單位中的TM4-TM5相互交叉，并且結合與之相對的亞單位上的NBD。由內面結構所形成的穴因此也就由TM4和TM6來確定（Fig.2b）。如果LLO的焦磷酸和寡

23、聚糖鏈部分進入了這個穴中，LLO分子會在翻轉過程中被“掐斷”，因為TM4和TM6之間的間隙會關閉，而一個新的開向外面的間隙（TM1和TM3之間）會打開。這會困住LLO分子，并且產(chǎn)生嚴重的原子空間碰撞，從而阻礙底物的釋放。基于以上的考慮，不可避免地會得出這樣一個結論——在PglK催化的翻轉過程循環(huán)中，內部的穴并不參與LLO的結合。</p><p>　　外部穴與內部穴在化學屬性上完全不同。翻閱以前的研究，我們基于Sa

24、v1866構建了一個完整的PglK的外部穴的結構。這一模型具有一個和胞外閉合結構相似的穴，但有一個更大的開向細胞膜胞質一側的開口（Fig.4a，b）。在兩種狀態(tài)下，外部的穴幾乎跨過了整個細胞膜，并且雖然向胞外閉合部分無法提供充足的空間來容納LLO的焦磷酸和寡聚糖鏈部分，但是整個外部空間卻可以。我們確定了排列在外部穴內面的多個Arg殘基（R86，R260，R302和R309）共產(chǎn)生了八個正電荷（Fig.4b）。由于在ABC轉運體從朝內狀態(tài)

25、變?yōu)槌鉅顟B(tài)的剪切運動，這些Arg被包埋，在朝內構象時形成鹽橋；但是當PglK變?yōu)槌鈽嬒蠡蛘呦虬忾]合時，卻暴露出來。因為Arg也許會參與LLO的焦磷酸部分的結合，我們產(chǎn)生了每個位點的單個Ala替換突變（R86A，R260A，R302A和R309A）和一個所有電荷都缺失了的四位點的突變。雖然單位點突變體在體內和體外仍然具有一定程度的催化翻轉活性，但是，四位點突變體無法催化LLO翻轉（Fig.4d，e）。而且，雖然單位點突變體的ATP酶

26、活性可被LLO一定程度的激活（盡管基礎ATP酶活性有所下</p><p><b>　　翻轉機制</b></p><p>　　日積月累的生化和結構資料讓我們提出了一個PglK催化LLO翻轉的機制，如Fig.5所示。PglK與催化活性相關的兩種構象分別稱為向胞外閉合構象（ADP結合狀態(tài)）和朝外構象（ATP結合狀態(tài)）。鑒于細胞內的ADP和ATP濃度只有微摩級，轉運體的分離狀

27、態(tài)，以一種朝內結構為代表，可能是短暫而稀少的。ATP和ADP之間的快速交換，不會允許同二聚體蛋白PglK的所有ATP結合部位同時處于一種未結合核苷酸的狀態(tài)。我們提出這樣一種假設，當LLO的多聚異戊二烯尾與PglK表面的EH及其周邊相互作用時，其焦磷酸部分直接進入ATP結合狀態(tài)時的外部穴中，并與Arg殘基之間產(chǎn)生靜電作用。而寡聚糖鏈部分則跟隨焦磷酸部分，但在轉運過程中不需與PglK產(chǎn)生任何特定的相互作用。這也就能夠解釋翻轉反應對多糖長度的

28、低選擇性或者低特異性。這一假說與觀察到PglK可轉運通常由MOP（multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide）型翻轉酶Wzx所轉運的不同的LLOs。這也可以說明相關的ABC型翻轉酶是如何在菌體抗原產(chǎn)生過程中轉運長的、直線型的高聚糖鏈：因為延長了的寡聚糖鏈被想象為</p><p>　　我們推斷出來的PglK催化下的LLO翻轉機制與P4-ATP翻轉酶催化磷脂翻轉的“

29、刷卡”模型（“credit card swipe”model）有些相似。不過有兩個重要的區(qū)別：一是多聚異戊二烯尾借由EH與PglK表面相識別，二是在翻轉過程中需要一個長的、足夠寬的可以容納下焦磷酸和官井頭路部分的轉運通道。我們的機制與MsbA作用機制是有區(qū)別的，那一機制認為整個脂質A核心都應該是進入了轉運體內部的、無核苷酸狀態(tài)中。更概括的說，我們提出的這個假設與用于解釋轉運小的、親水底物的轉運機制的交替通路模型也是有區(qū)別的。</p

30、><p><b>　　結論</b></p><p>　　我們的結果確定了ABC轉運體催化脂連接寡聚糖鏈翻轉過程的結構和機制基礎。這些資料揭示了一種適用于含有焦磷酸部分和線性多聚糖鏈的大頭部基團翻轉機制。頭部基團在轉運過程中被脂雙層所保護。我們猜測直接進入朝外構象和脂肪尾與轉運體朝膜表面的相互作用也許會是其他ABC類型的LLO翻轉酶的一個特征，甚至也或許是在細菌細胞壁形成或