堆型艾美耳球蟲pcDNA3-3-1E重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲引起的一種對雞危害極為嚴重的全球性寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對該病的防治主要以化學合成藥及抗生素為主，由于長期應(yīng)用易使雞群產(chǎn)生抗藥性，且在禽類產(chǎn)品中因有藥物殘留而影響人類健康。這使研究者將目標轉(zhuǎn)移到了疫苗的研制方面，用分子生物學方法來預防球蟲病具有潛在的優(yōu)越性。本試驗以雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina，E.acervulina）為研究對象，構(gòu)建了針對第二代裂殖子表面抗原3-1E

2、基因的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-3-1E，并用該重組質(zhì)粒作為DNA疫苗進行了免疫試驗，為研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　 參考GenBank中收錄的E.acervulina美國株（US株）裂殖子3-1E基因序列，設(shè)計特異性引物，以保定株堆型艾美耳球蟲裂殖子RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）法擴增3-1E基因，經(jīng)檢測擴增產(chǎn)物為689bp。將擴增的 3-1E基因克隆至PGM-T Easy載

3、體，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞Top10，藍白斑法篩選出陽性重組子，提取陽性質(zhì)粒DNA并測序。序列分析結(jié)果表明，該株的3-1E基因序列與參考序列（US株）同源性達99.6％，表明其具有很高的保守性。
　　 以克隆質(zhì)粒PGM-3-1E為模板，擴增3-1E基因閱讀框。將擴增產(chǎn)物與原核表達載體pET28a(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-3-1E，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明表達出的重

4、組蛋白分子量大小約為22kDa；經(jīng)Western blot鑒定結(jié)果表明該重組蛋白可被抗堆型艾美耳球蟲的多克隆抗體識別，說明其具有很好的反應(yīng)原性。
　　 將擴增的3-1E基因閱讀框插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA-3-1E，pcDNA-3-1E經(jīng)酶切和PCR鑒定均為陽性，測序分析為正向插入。用堿裂解法大量提取重組表達質(zhì)粒，純化后作為核酸疫苗接種一周齡雛雞。分別設(shè)高(100μg)、中(50μg)

5、、低(25μg)三個劑量組，同時設(shè)3-1E重組蛋白免疫組、活卵囊接種組、非免疫感染組和健康對照組。在7日齡時首免，14日齡加強免疫，一周后用2.5×105個E.acervulina BD株球蟲孢子化卵囊進行攻毒試驗。結(jié)果顯示50μg的劑量可使試驗雞產(chǎn)生較強的抗蟲效果：攻蟲后雞的卵囊產(chǎn)量下降67.67％，腸道病變記分降低66.96％，并使雞的相對增重率達88.36％，ACI值為167.06。
　　 將純化后重組表達質(zhì)粒pcDNA3