中國地區(qū)亞洲韌皮桿菌多樣性分析及多重PCR檢測柑橘黃龍病和潰瘍病.pdf

1、柑橘黃龍病(HLB)是一種毀滅性的柑橘病害?？梢允垢涕贉p產(chǎn)、破壞果品經(jīng)濟價值甚至柑橘植株死亡。該病害主要通過嫁接和木虱媒介傳播，現(xiàn)在廣泛分布于亞洲各國、印度次大陸及印度洋地區(qū)、非洲南部和最近報道的美國、巴西和古巴。其病原菌為韌皮桿菌(Candidatus Liberibacter)，簡稱柑橘黃龍病菌。柑橘黃龍病菌是一種生活在柑橘病株韌皮篩管組織以及媒介昆蟲木虱體內(nèi)的原核生物，分類上屬于變形細菌門(Proteobacteria)α-亞綱。

2、根據(jù)流行的地理區(qū)域、環(huán)境條件與媒介昆蟲等的不同可以將柑橘黃龍病菌分成以下三個種：亞洲韌皮桿菌(Candidatus Liberibacter asiaticus，Las)、非洲韌皮桿菌(Ca.L.africanus，Laf)和美洲韌皮桿菌(Ca.L. americanus，Lam)。其中亞洲種和美洲種通過亞洲柑橘木虱(Diaphorina citri)傳播并具有一定的耐熱性。非洲種通過非洲木虱(Trioza erytreae)傳播是一種

3、熱敏感型黃龍病菌。該病原細菌至今不能進行人工純培養(yǎng)，同時也沒有通過科赫氏(Koch)鑒定。
　　 由于缺乏有效的殺菌劑和柑橘抗病品種，很多國家一旦發(fā)現(xiàn)病樹只能通過根除和燒毀病樹的方式阻止柑橘黃龍病的蔓延。因此對柑橘黃龍病的流行病學(xué)研究就顯的尤為重要，從而為柑橘黃龍病的防治提供幫助。本研究工作的主要內(nèi)容就是研究中國南部各柑橘主產(chǎn)區(qū)(廣東、廣西、浙江、福建、江西、海南等省)的亞洲韌皮桿菌的遺傳多樣性。采用的方法為：基于亞洲韌皮桿菌外

4、膜蛋白(outermembrane protein gene，omp)基因的限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)的方法來研究中國南部各柑橘主產(chǎn)區(qū)的亞洲韌皮桿菌的遺傳多樣性。首先采用omp基因特異性引物對擴增出來自中國南部6省的11個亞洲韌皮桿菌菌株的外膜蛋白基因并進行克隆。其次挑選每個地區(qū)具有代表性菌株的omp基因進行DNA測序，將所得的核酸序列被推導(dǎo)成其編碼的

5、氨基酸序列多重比對后，通過最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。此外還選取不同的DNA限制性內(nèi)切酶消化所有亞洲韌皮桿菌的omp基因，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離各個條帶，然后紫外成像記錄不同的RFLP指紋圖譜。
　　 研究結(jié)果顯示：中國南部各柑橘主產(chǎn)區(qū)的亞洲韌皮桿菌omp基因產(chǎn)生的RFLP指紋圖譜均不相同，這表明南方各省柑橘主產(chǎn)區(qū)的柑橘黃龍病菌具有一定的遺傳多樣性。即便在某一特定的地區(qū)(廣西壯族自治區(qū))也有一定的差異。此外通過序列分析發(fā)現(xiàn)

6、中國不同地區(qū)的亞洲韌皮桿菌具有很高的同源性，其核苷酸序列的同源性高達99％，但沒有發(fā)現(xiàn)其它種的韌皮桿菌(非洲種韌皮桿菌和美洲種韌皮桿菌)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有的韌皮桿菌被分為兩大類，一類為非洲種韌皮桿菌，一類為亞洲種韌皮桿菌。這些結(jié)果對揭示中國地區(qū)的柑橘黃龍病的流行病學(xué)提供了有用的數(shù)據(jù)，并為相關(guān)部門制定科學(xué)有效的防治策略具有一定的指導(dǎo)意義。
　　 本研究工作的另一部分是建立一種柑橘HLB和潰瘍病(CBCD)檢測的多重PCR(mPC

7、R)檢測體系。先前的報道發(fā)現(xiàn)，在東南亞地區(qū)的很多柑橘產(chǎn)區(qū)都存在HLB和CBCD同時感染的情況。隨著2005年在巴西和美國的佛羅里達州相繼發(fā)現(xiàn)了柑橘HLB，這樣以來同時感染柑橘HLB和CBCD的地區(qū)正逐漸增多。因此，建立早期診斷的和快速檢測的體系就顯得尤為必要。在這部分研究工作中，一套mPCR檢測HLB和CBCD的檢測體系被建立。該體系使用的特異性引物分別根據(jù)Las核糖體蛋白基因和CBCD病原菌Xanthomonas axonopodis

8、 pv.citri(Xac)的特異蛋白編碼基因設(shè)計的。此外，還有一對根據(jù)柑橘18S rDNA保守序列設(shè)計的內(nèi)參引物用作mPCR體系的內(nèi)置陽性對照(IPC)。最終優(yōu)化的體系能夠在一次PCR反應(yīng)中同時擴增193bp、253bp、382bp的三段靶序列。將mPCR體系與單重PCR進行比較，并通過測序予以證實得出：這套mPCR體系的靈敏度和特異性與單重PCR的相當(dāng)。通過田間實際樣品檢測發(fā)現(xiàn)廣西北海地區(qū)某些柑橘種植園被柑橘HLB和CBCD同時感染