功能內(nèi)生菌強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤的作用與機(jī)制研究.pdf

1、土壤重金屬污染是當(dāng)今世界上一個(gè)重要的環(huán)境問題，給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成了極大風(fēng)險(xiǎn)。植物修復(fù)具有原位、成本低且環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ耐寥乐亟饘傥廴局卫硇录夹g(shù)。然而，這種基于植物的技術(shù)通常由于危害植物的毒性和有限的重金屬生物可利用性而導(dǎo)致修復(fù)效率較低，阻礙了它的大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用。因此，如何提高植物修復(fù)效率成為了目前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。其中，研究利用具有特殊生物學(xué)功能的微生物來協(xié)同植物提高修復(fù)效率成為目前最為活躍的領(lǐng)域之一。在此背景

2、下，本論文開展了功能微生物的篩選及其強(qiáng)化植物修復(fù)土壤重金屬污染的作用與機(jī)理的研究，從而為利用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)修復(fù)土壤重金屬污染的實(shí)際應(yīng)用提供優(yōu)良菌種資源、理論基礎(chǔ)和技術(shù)路線。
　　本文首先選定鎘(Cd)超累積植物龍葵及其內(nèi)生細(xì)菌為研究植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的材料和對(duì)象，通過對(duì)重金屬污染環(huán)境下龍葵內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，獲得了龍葵內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)特征及其與宿主植物、重金屬間的相互作用關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上

3、分離篩選具有潛力的功能內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于強(qiáng)化龍葵修復(fù)土壤重金屬污染，構(gòu)建了新型高效的“龍葵-功能內(nèi)生菌”的聯(lián)合修復(fù)載體，并深入探討了聯(lián)合修復(fù)過程中的功能內(nèi)生菌與宿主植物間的相互作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)重金屬污染條件下超累積植物龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了解析，從而獲得了龍葵內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)特征信息。16SrDNA克隆文庫及序列分析表明龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性豐富。其中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的類群為變形菌門(Proteo

4、bacteria，61.93％)，包含α(41.12％)、β(6.09％)和γ(14.72％)亞類;另外還有放線菌門(Actinobacteria，18.78％)、擬桿菌門(Bacteroidetes，12.18％)、厚壁菌門(Firmicutes，2.03％)以及未被分類菌(Unclassifiedbacteria，5.08％);而優(yōu)勢(shì)種屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas），分別占克隆文

5、庫的24.37％和12.18％。此外，分別對(duì)龍葵根和莖的克隆子序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比較發(fā)現(xiàn)龍葵根和莖中的內(nèi)生細(xì)菌種類存在差異，表明不同的內(nèi)生細(xì)菌通過自身定殖能力占據(jù)著不同的生態(tài)位。
　　(2)利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對(duì)比分析了不同重金屬污染水平下龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異以及同一重金屬污染水平下龍葵與商陸內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，揭示了內(nèi)生細(xì)菌群落與重金屬污染、宿主植物間的相互作用關(guān)系。不同重金屬污染水平會(huì)導(dǎo)致龍葵體內(nèi)呈現(xiàn)

6、不同的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，隨著重金屬污染程度的加劇會(huì)使有的物種消失，但也會(huì)使一些重金屬耐性菌群有增加的趨勢(shì)。同一重金屬污染水平下的龍葵和商陸的內(nèi)生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)也存在較大差異。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）在龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，分別為總數(shù)的23.35％和12.18％;而在商陸內(nèi)生細(xì)菌群落中，假單胞菌屬（Pseudomonas）和土壤桿菌屬（Agrobacterium）數(shù)量

7、最多，分別占到21.4％和12.44％。綜上所述，重金屬污染水平以及超累積植物類型的不同都會(huì)影響超累積植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。
　　(3)通過平板分離培養(yǎng)方法分析了龍葵重金屬抗性內(nèi)生細(xì)菌多樣性并考察它們的功能性質(zhì)和應(yīng)用潛能。從生長(zhǎng)于重金屬礦區(qū)的超累積植物龍葵體內(nèi)分離篩選出具有多種重金屬抗性的純培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌30株，通過序列鑒定主要有微桿菌屬（Microbacterium），芽孢桿菌屬（Bacillus），節(jié)桿菌屬（Arthro

8、bacter），黃桿菌屬（Flavobacterium），金黃桿菌屬（Chryseobacterium），土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），假單胞菌屬（Pseudomonas），沙雷氏菌屬（Serratia）以及短桿菌屬（Curtobacterium）等種屬。生物學(xué)特性表征發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)、鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶能力的內(nèi)生細(xì)菌分別占到70％、50％

9、和56％，而具有固氮和增磷能力的菌株相對(duì)較少，分別只有10株和8株。功能內(nèi)生菌株侵染龍葵幼苗的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某單個(gè)功能特性與幼苗生長(zhǎng)參數(shù)間并沒有明顯的相關(guān)性，但當(dāng)某菌株同時(shí)具備多種功能特性時(shí)則對(duì)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。
　　(4)將從龍葵體內(nèi)分離篩選的4株兼具重金屬抗性和多種促生功能性質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于重金屬污染修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，分析和探討了將這些功能菌株接種至原宿主龍葵強(qiáng)化其修復(fù)不同水平Cd污染土壤的效果與可能機(jī)制。結(jié)果表明，集產(chǎn)

10、IAA、分泌鐵載體以及ACC脫氨酶活性等能力于一身的促生功能內(nèi)生細(xì)菌表現(xiàn)出了期望的促進(jìn)龍葵生長(zhǎng)增加生物量的作用。在12.1mg/kgCd污染土壤中，效果最為明顯的菌株為Enterobactersp.LSE04，接種該菌的龍葵地上部的高度、鮮重和干重比對(duì)照組分別提高了13.7％、28.2％和41.4％;在63.7mg/kgCd污染土壤中，效果最為明顯的菌株為Acinetobactersp.LSE06，接種該菌的龍葵地上部的高度、鮮重和干重

11、比對(duì)照組分別提高了10.9％、15.7％和23.1％;而在116.5mg/kgCd污染土壤中，接種SerratianematodiphilaLRE07的效果最為顯著，分別提高了18.9％、23.1％和19.8％。促生功能細(xì)菌的接種對(duì)龍葵根、莖、葉中Cd濃度也有一定提高，如在63.7mg/kgCd污染土壤中，促進(jìn)效果最為明顯的菌株為L(zhǎng)RE07，分別提高了21.3％、15.6％和11.9％。加之生物量的提高，接種了菌株的龍葵其體內(nèi)累積的總C

12、d含量提高顯著，在63.7mg/kg污染下，接種LRE07對(duì)根部和地上部總Cd累積量為未接菌對(duì)照的1.69倍和1.37倍。綜上所述，將篩選的促生功能內(nèi)生菌回殖龍葵提高了其修復(fù)Cd污染土壤的效率，在緩解重金屬壓力增加生物量的同時(shí)也促進(jìn)了重金屬的吸收。
　　(5)將篩選的一株同時(shí)具有產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)生物表面活性劑和代謝產(chǎn)酸功能的內(nèi)生細(xì)菌Pseudomonassp.Lk9應(yīng)用于強(qiáng)化Cd超累積植物龍葵修復(fù)Cd、Zn和Cu的多金屬復(fù)合污染土壤，

13、試驗(yàn)評(píng)估了“Lk9-龍葵”復(fù)合修復(fù)載體的修復(fù)效果并探討了“Lk9-龍葵”的相互作用機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，功能內(nèi)生菌Lk9的接種能夠改善土壤中Fe和P等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的供應(yīng)、提高土壤中重金屬的生物可利用性以及影響龍葵根系低分子量有機(jī)酸的分泌。與未接種的對(duì)照相比，Lk9的接種顯著增加了龍葵地上部生物量（地上部提高了14％）和重金屬的累積（地上部Cd、Zn和Cu的累積量分別提高了46.6％、16.4％和16％）。評(píng)估植物修復(fù)的效能發(fā)現(xiàn)，Lk9接種