生物科學(xué)畢業(yè)論文厚殼貽貝m7 lysin基因的序列分析

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　厚殼貽貝M7 lysin基因的序列分析</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、生物科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>

3、;</p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法2</b></p><p>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料2</p>

4、;<p>　　1.2儀器與設(shè)備2</p><p>　　1.3藥品與試劑2</p><p>　　1.4實(shí)驗(yàn)方法2</p><p>　　1.4.1PCR擴(kuò)增2</p><p>　　1.4.2產(chǎn)物回收與測序3</p><p>　　1.4.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)4</p>

5、<p>　　1.4.4數(shù)據(jù)處理與分析4</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)結(jié)果5</b></p><p>　　2.1厚殼貽貝M7 lysin cDNA序列分析5</p><p>　　2.2厚殼貽貝M7 lysin氨基酸序列分析6</p><p><b>　　3討論7</b

6、></p><p>　　3.1厚殼貽貝M7lysin序列分析7</p><p>　　3.2M7 lysin的分子標(biāo)記特征7</p><p><b>　　小結(jié)8</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)9</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽

7、。</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　[摘要] M7 lysin位于貽貝精子頂體中，是溶解卵黃膜、促進(jìn)受精作用的重要蛋白質(zhì)，決定了貽貝種間精卵識(shí)別的特異性。本實(shí)驗(yàn)提取厚殼貽貝雄性性腺總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板，通過兼并性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得目的片段，再將PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行割膠回收，連接入T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性克隆測序

8、。發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框cDNA為543bp，與貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝具有較高的相似性；在線翻譯所得蛋白質(zhì)片段中含有180個(gè)氨基酸，分子量為20kD，等電點(diǎn)為8.48；通過M7 lysin氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，貽貝和地中海貽貝親緣關(guān)系最近，其次為蓋勒貽貝，最后是厚殼貽貝。上述研究結(jié)果提示，M7 lysin可作為分子標(biāo)記研究貽貝進(jìn)化特征，并有利于揭示貽貝的生殖機(jī)理，為貽貝的雜交育種提供參考。</p><p>

9、　　[關(guān)鍵詞] 厚殼貽貝；M7 lysin；克隆；測序</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] M7 lysin is located in the mussel sperm acrosome. As an important protein for fertilization it can dissolve

10、vitelline membrane and determine the specificity of sperm-egg recognition of mussel. In this study, we cloned M7 lysin of Mytilus coruscus with homology cloning method, and expressed it in prokaryotes. The results showe

11、d that the amplified product was about 540bp fragment. The further sequencing found that the cDNA of open reading frame was 543bp, and it had high similarity wit</p><p>　　[Key words] Mytilus coruscus Gould;

12、M7 lysin; cloning; sequencing</p><p><b>　　引 言</b></p><p>　　貝類是典型的廣播生殖細(xì)胞、體外受精的無脊椎動(dòng)物，其精子在卵細(xì)胞表面經(jīng)歷復(fù)雜的頂體反應(yīng)，并最終與卵細(xì)胞膜相融合，這就決定精卵細(xì)胞中必定存在某種特殊的物質(zhì)，使兩性細(xì)胞能在廣闊的水體中得以識(shí)別并結(jié)合。經(jīng)前人研究發(fā)現(xiàn)，軟體動(dòng)物精子頂體當(dāng)中的細(xì)胞溶素（ly

13、sin）在此過程中發(fā)揮了重要作用。作為典型的海產(chǎn)無脊椎動(dòng)物，貽貝的受精作用和胚胎發(fā)育都在體外進(jìn)行，但研究發(fā)現(xiàn)，雖然很多種貽貝共同生活在相同的海水環(huán)境中，而且生殖季節(jié)相互交疊，卻很少產(chǎn)生種間雜交現(xiàn)象，其原因就是異種間配子不能識(shí)別，無法受精，即存在生殖隔離現(xiàn)象。研究表明，成熟的貽貝精子具有發(fā)達(dá)的頂體泡，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)，其中只有M7 lysin與生殖密切有關(guān)，該分子所發(fā)揮的作用與鮑頂體的lysin蛋白非常類似，能夠溶解卵黃膜，促進(jìn)受精作用的完

14、成，同時(shí)該分子也是貽貝間生殖隔離的關(guān)鍵所在。</p><p>　　厚殼貽貝（Mytilus coruscus Gould），俗稱青口、海紅，其干制品稱淡菜，有很高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有很好的藥用和保健功效，是我國目前主要的貝類養(yǎng)殖品種之一。近年來，由于種質(zhì)、病害和環(huán)境等因素的影響，厚殼貽貝出現(xiàn)了自身體質(zhì)下降、幼苗成活率低、性成熟過早、出肉率低等問題，因此培育生長狀態(tài)好、抗逆能力強(qiáng)的優(yōu)良品種成為解決貽貝養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的

15、技術(shù)關(guān)鍵之一。雜交育種是培育良種的一條有效途徑，為解決我國養(yǎng)殖貝類大規(guī)模死亡和一些重要經(jīng)濟(jì)貝類生長慢、生產(chǎn)周期長等問題開辟了嶄新途徑。因此探明厚殼貽貝生殖隔離機(jī)制，將促進(jìn)其雜交育種快速實(shí)現(xiàn)，為培育厚殼貽貝良種提供科學(xué)依據(jù)。目前對(duì)于貽貝精子M7 lysin人們也進(jìn)行了探索性研究，其中貽貝（Mytilus edulis Linnaeus）、地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis Lamarck）、蓋勒貽貝（Mytil

16、us trossulus Gould）M7 lysin序列已經(jīng)測得，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其進(jìn)化與lysin、bindin類似，為正向選擇方式，并在生殖隔離及物種進(jìn)化中起重要作用，但關(guān)于厚殼貽貝（Mytilus coru</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　

17、　厚殼貽貝取自舟山市嵊泗縣養(yǎng)殖海區(qū)，活體解剖觀察性腺確定性別，取雄性性腺組織立即放入液氮中保存。</p><p>　　宿主菌E.coli DH5α、Rosseta T M （DE3）、表達(dá)載體pET-28a、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaq酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒AxyGEN Gel Extraction Kit購自愛思進(jìn)生物

18、技術(shù)有限公司；TA克隆試劑盒T-Vector PCR Product Cloning Kit購自上海生工。</p><p><b>　　儀器與設(shè)備</b></p><p>　　PCR儀：PTC-200型，Bio-RAD；</p><p>　　離心機(jī)：Enpendoff；</p><p>　　電泳儀：DYY-8C型，北京六

19、一。</p><p><b>　　藥品與試劑</b></p><p>　　dNTP混合物 　  Takara</p><p>　　Taq DNA聚合酶 　  Takara</p><p>　　10×PCR Buffer（含Mg2+）

20、 Takara </p><p>　　DNA 回收試劑盒 AxyPrep DNA Gel ExtrActioN Kit</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　PCR擴(kuò)增</b></p><p>　　擴(kuò)增引物 SMH-G-F：GA

21、Y CCN CTT TTC TAY CT</p><p>　　SMH-G-R：ATN TCG TGY TGT CCT CC</p><p>　　以厚殼貽貝組織cDNA為模板，按下列組分配成PCR反應(yīng)液：</p><p>　　把上述 PCR反應(yīng)液加入到薄壁管中，輕輕混勻。再按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：</p><p><b>　　產(chǎn)物回

22、收與測序</b></p><p>　　在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計(jì)算凝膠重量，以該重量作為一個(gè)凝膠體積。使用AxyPrep DNA Gel ExtrActioN Kit進(jìn)行純化。</p><p>　　把上述 PCR反應(yīng)液加入到薄壁管中，輕輕混勻。再按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：</p><p>　?。?）加入3個(gè)凝膠體積的BufferDE-A

23、，混合均勻后于75℃加熱，每隔2～3min混合，直至凝膠完全融化；</p><p>　?。?）加入0.5個(gè)BufferDE-A體積的BufferDE-B，混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于400Bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇；</p><p>　?。?）吸取3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管放在2mL的離心管中，12000g離心1min，棄濾液；</p><p

24、>　?。?）將制備管置回離心管，加0.5mL的Buffer W1，12000g離心1min，棄濾液；</p><p>　?。?）將制備管置回離心管，加0.7mL的Buffer W2，12000g離心1min，棄濾液；</p><p><b>　　（6）重復(fù)步驟5；</b></p><p>　?。?）將制備管置于2mL離心管中，12000g

25、離心1min；</p><p>　?。?）將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在DNA制備膜正中央加25μL的ElueNt，室溫下靜置1min，12000g離心1min洗脫DNA。</p><p>　　連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)</p><p>　?。?）-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置5min，待感受態(tài)融化；</p><p>　?。?/p>

26、2）往感受態(tài)中加入5μL的連接液，用Tip頭混勻后置于冰浴上；</p><p>　?。?）冰浴30min后，42℃水浴上熱激90s，再置于冰浴上2min；</p><p>　?。?）加500μL的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃，250rpm恢復(fù)培養(yǎng)1h；</p><p>　　（5）混勻菌液，吸60μL涂在對(duì)應(yīng)抗性的LB平板(含50μg/μL Amp或者Kana)上；<

27、;/p><p>　　（6）置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱，正面朝上放置30min后翻板；</p><p>　　（7）37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14h后，即可長成單菌落。</p><p>　　利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，所獲得的克隆利用原 PCR 擴(kuò)增引物進(jìn)行菌落 PCR 鑒定后，送上海英駿生物公司測序。</p><p><b>　　數(shù)據(jù)處理與分析<

28、;/b></p><p>　　測序結(jié)果經(jīng)去除載體序列后，在 NCBI （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行在線BLAST 同源檢索進(jìn)行；推導(dǎo)成熟肽的分子量及等電點(diǎn)利用在線軟件（http: //www. expasy. org/ tools/ pi tool. html）預(yù)測；序列 比 對(duì) 分 析 采 用MEGA4.0 軟件中 Clustal W 模塊進(jìn)行，

29、同時(shí)對(duì)貽貝、太平洋貽貝、厚殼貽貝M7 lysin的氨基酸序列構(gòu)建 N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　厚殼貽貝M7 lysin cDNA序列分析</p><p>　　將PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行割膠回收，連接入T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性克隆測序。測序結(jié)果經(jīng)分析并去除載體序列，得到厚殼貽貝M7 lys

30、in的ORF序列，結(jié)合已發(fā)表貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝相應(yīng)分子序列進(jìn)行比對(duì)，如（圖3）所示，共存在77個(gè)突變位點(diǎn)，占總堿基數(shù)量的14.2%。其中貽貝和地中海高度相似（相似度97.8%），原因在于二者為同種貽貝，在不同的地區(qū)命名方式略有差別，但其堿基序列不完全一致。蓋勒貽貝與上述兩個(gè)貽貝略有差別（34個(gè)堿基），相似度93.7%；厚殼貽貝則差別較大，與貽貝相似度為88.6%，（ 62個(gè)堿基），與地中海貽貝相似度為89%（60個(gè)堿基），與蓋勒

31、貽貝相似度為89%（60個(gè)堿基）。因此從M7 lysin分子判斷蓋勒貽貝與貽貝及地中海貽貝具有比厚殼貽貝更近的親緣關(guān)系。</p><p>　　厚殼貽貝M7 lysin氨基酸序列分析</p><p>　　所得ORF序列經(jīng)DNAMAN軟件翻譯為180個(gè)氨基酸的多肽鏈，http://www.expasy.ch/tools/在線預(yù)測分子量為20k，等電點(diǎn)為8.48，低于腹足類lysin分子（10.

32、0-11.6），盡管腹足類與雙殼類具有共同的祖先，但二者的lysin分子沒有明顯的同源性。厚殼貽貝氨基酸序列較其他貽貝分化較大（如圖2），與貽貝和地中海相似度為91%，與蓋勒貽貝相似性為89.4%。對(duì)貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝、厚殼貽貝M7 lysin的氨基酸序列構(gòu)建 N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹如（圖3）所示，貽貝與地中海貽貝首先聚為一支，其次為蓋勒貽貝，最后則是厚殼貽貝。</p><p><b>　　討 論&l

33、t;/b></p><p>　　厚殼貽貝M7lysin序列分析</p><p>　　無脊椎動(dòng)物的精子頂體蛋白lysin在受精過程中擔(dān)負(fù)著溶解卵黃膜、促進(jìn)精子與卵細(xì)胞相結(jié)合的重要功能，因其參與前合子生殖隔離和物種形成而受到廣泛重視。與其他lysin分子相同，貽貝M7 lysin位于精子頂體中，能夠溶解卵黃膜，但其結(jié)構(gòu)并不與腹足類的lysin相似，主要原因在于該類分子進(jìn)化速度極快，種間的

34、這種高度分化特征因此顯而易見，本研究也證實(shí)了該結(jié)論，克隆得到的厚殼貽貝M7 lysin序列通過BLAST在線檢索，除了與貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝具有88-89%的相似性外，并未找到包括腹足類精子蛋白在內(nèi)的任何與之具有明顯相似性的序列，該結(jié)果表明，M7 lysin參與了貽貝受精作用的種的特異性。雖然貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝分布區(qū)域相互交疊，但各物種之間的分化特征仍舊明顯，種間雜交的現(xiàn)象并不普遍，盡管自然界由于基因漂流與漸滲存在貽貝與地

35、中海貽貝及厚殼貽貝的雜交后代，但雜交貽貝在自然界的數(shù)量并不多，在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)兩種貽貝雜交則需要高濃度的精子的參與，因此對(duì)M7 lysin特征的研究將有利于闡明貽貝生殖機(jī)理，促進(jìn)雜交育種的實(shí)踐探索。</p><p>　　M7 lysin的分子標(biāo)記特征</p><p>　　貽貝屬的廣泛分布及生存環(huán)境對(duì)其貝殼外形的影響使該屬的分類相對(duì)混亂，在貽貝分類研究方面，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的報(bào)道，特別是

36、貽貝、地中海貽貝和蓋勒貽貝的形態(tài)極其相似而難以區(qū)分。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于貽貝屬的分類研究。很多研究者通過同工酶基因位點(diǎn)、線粒體基因組全序列、12SrRNA、16SrRNA及COI序列等對(duì)貽貝分類開展了系列研究，結(jié)果普遍認(rèn)為，地中海貽貝和貽貝最相似，兩者與蓋勒貽貝遺傳距離稍遠(yuǎn)，其次為厚殼貽，本研究以M7 lysin作為分子標(biāo)記所得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹同樣得到了該結(jié)論。前人的研究結(jié)果顯示，貽貝M7 lysin進(jìn)化速度極快

37、，降低了各貽貝配子種間的相容性，因此形成了貽貝群體間生殖隔離，促進(jìn)新物種的形成，因此以M7 lysin作為分子標(biāo)記，更能反映貽貝的生物多樣性的迅速變化，該方面研究將豐富國際上生物多樣性的研究理論和方法，也為其它種類生物多樣性研究提供必要的理論依據(jù)。</p><p><b>　　小 結(jié)</b></p><p>　　近20年來,我國大力發(fā)展海洋資源。在醫(yī)藥衛(wèi)生方面，已經(jīng)研

38、究并開發(fā)出了大量海洋藥物和海洋食品。國內(nèi)外對(duì)貽貝的藥用食用價(jià)值已經(jīng)做了大量的研究工作，取得了不少成果，部分已在醫(yī)藥及食品的生產(chǎn)中得到應(yīng)用。印度等國正準(zhǔn)備投巨資研究開發(fā)，使之成為一大高科技產(chǎn)業(yè)。</p><p>　　貽貝在我國養(yǎng)殖區(qū)域廣，產(chǎn)量大，無論從藥用的角度，還是從保健食療的角度均具有廣闊的開發(fā)前景。在我國,貽貝主要是新鮮或粗加工后供民間食用，如果能結(jié)合研究成果，加強(qiáng)活性成分的確定、分離、提取、藥理和臨床等基礎(chǔ)

39、研究，發(fā)展出相關(guān)的保健食品及藥品，不僅對(duì)疾病的預(yù)防和治療有貢獻(xiàn)，而且會(huì)產(chǎn)生較大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。</p><p>　　基因序列分析是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，最終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對(duì)功能的影響，幫助人工合成基因、設(shè)計(jì)引物等。自1990年人類基因組計(jì)劃（HGP）啟動(dòng)以來，尤其是在最近5年中，基因

40、組研究有了長足地進(jìn)展。此外，為了揭示基因功能，開發(fā)個(gè)性化藥物和明確生物物種間的進(jìn)化關(guān)系以及不同生物體生命活動(dòng)的異同，也需要人們對(duì)更多的基因組進(jìn)行測序。從這個(gè)意義上說，“基因組測序僅僅是個(gè)開始”。基因組研究的發(fā)展呼喚新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)。</p><p>　　因此本次實(shí)驗(yàn)以厚殼貽貝為材料，運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增得到M7 lysin基因片段，并證明從M7 lysin分子判斷蓋勒貽貝與貽貝及地中海貽貝具有比厚殼貽貝更

41、近的親緣關(guān)系。進(jìn)一步測序分析發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝氨基酸序列較其他貽貝分化較大，與貽貝和地中海相似度為91%，與蓋勒貽貝相似性為89.4%。對(duì)貽貝、地中海貽貝、蓋勒貽貝、厚殼貽貝M7 lysin的氨基酸序列構(gòu)建 N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹，貽貝與地中海貽貝首先聚為一支，其次為蓋勒貽貝，最后則是厚殼貽貝。明確厚殼貽貝與其他種類的貽貝的進(jìn)化關(guān)系后將為研制抗菌新藥提供理想分子設(shè)計(jì)骨架和模板，為發(fā)展新的抗感染藥物奠定重要基礎(chǔ)。</p><p&g

42、t;<b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　Sinclair A J, Murphy K J, Li D. Marine lipids: overview“newsinsights and lipid composition of Lyprinol”[ J]·AllergImmunol (Paris), 2000, 32(7): 261-271</p>&

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