相關序列擴增多態(tài)(srap)在農作物遺傳育種中的應用

1、<p>　　相關序列擴增多態(tài)(SRAP)在農作物遺傳育種中的應用</p><p>　　摘要:相關序列擴增多態(tài)(SRAP)是近幾年發(fā)展起來的新型分子標記技術,具有簡便、穩(wěn)定、高共顯性、易于得到選擇條帶序列等優(yōu)點。闡述了SRAP的原理和流程,論述了SRAP在作物遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性、基因定位等方面的研究進展及應用前景。 </p><p>　　關鍵詞:相關序列擴增多態(tài);原理;遺傳

2、圖譜;遺傳多樣性;基因定位 </p><p>　　AbstractSequence-Related Amplified Polymorphism(SRAP) is a new kind of DNA molecular markers,which possesses characteristics such as simplicity,reliability,high co-dominance and easil

3、y getting sequence of selected bands. SRAP principles and protocols were described and its research advances and application in such aspects as genetic mapping,genetic diversity,gene tagging and so on were overviewed. &l

4、t;/p><p>　　Key wordsSequence-Related Amplified Polymorphism;principles;genetic mapping;genetic diversity;gene tagging </p><p>　　我國有豐富的農作物品種,但天然品種總是在某些性質方面存在缺陷,如容易受到病蟲害感染、產量低等。因此,選育和推廣優(yōu)質的農作物新品種是農作物研

5、究的重要任務。分子標記輔助育種是利用分子遺傳標記,借助于目標基因緊密連鎖的遺傳標記的基因型分析鑒定含有目標基因的個體,從而提高選擇效率,減少盲目性,加速育種進程,在一定程度上彌補了傳統(tǒng)育種缺陷[1]。 </p><p>　　目前,用于植物基因組分析的分子標記有RFLP(restr-ication fragment length polymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)、RAPD(random amplif

6、ied polymorphic DNA,隨機擴增多態(tài)性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism,擴增片段長度多態(tài)性)、SSR(simple sequence repeat,簡單重復序列)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相關序列擴增多態(tài))等。其中RFLP標記雖然以共顯性方式遺傳,但由于它對DNA需求量大、實驗操作較繁瑣、檢測

7、周期長、成本費用高等限制了其廣泛引用;RAPD方法雖然簡單易行,需DNA量極少,但由于RAPD標記是一個顯性標記,不能識別純合子和雜合子,且其操作重復性較差;SSR具有高度的多態(tài)性、共顯性遺傳、選擇中性、易于操作等優(yōu)點,但SSR座位的篩選和特異引物的開發(fā)工作繁瑣且耗時費力,限制了其廣泛應用;AFLP技術發(fā)揮了檢測位點多、多態(tài)水平高、靈敏度高、結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點,但其</p><p>　　1SRAP標記簡介 <

8、;/p><p>　　SRAP標記是由美國加州大學作物系Li[2]于2001年在研究蕓薹作物時開發(fā)出來的一種標記技術,在油菜、水稻、小麥、棉花等農作物上的研究已體現出一定的應用價值[3-7]。 </p><p>　　1.1SRAP標記原理 </p><p>　　SRAP主要對植物基因組中ORFs(open reading frames,開放閱讀框)進行擴增,利用外顯子富含

9、GC而啟動子、內含子富含AT的特點設計引物。上游引物(也叫正向引物,forward primer)長17 bp,引物的3′端為3個選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,由一段填充序列和CCGG構成,主要結合在外顯子區(qū)域,對外顯子進行特異擴增。下游引物(也叫反向引物,reverse primer)長18 bp,引物的3′端仍為3個選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,其中核心序列前11 bp是一段填充序列,緊接著是AATT

10、,下游引物的結合位點在內含子區(qū)域或啟動子區(qū)域,對內含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增。由于內含子、啟動子與間隔序列長度在物種間或同一物種的不同個體間是不等的,因此用SRAP分析時會產生多態(tài)性[2]。 </p><p><b>　　1.2DNA擴增 </b></p><p>　　DNA擴增采用復性變溫法擴增,主要是為了保證引物與靶DNA配對,并且保證擴增片段的重復性。反應

11、體系中包括DNA 150 ng、dNTPs 0.2 mmoL/L、1.5 mmoL/L MgCl2、0.3 μmoL/L引物、1 U TaqDNA聚合酶。反應參數:94 ℃預變性5 min;循環(huán)30次,前5次循環(huán):95 ℃變性30 s,35 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s;后25次循環(huán):94 ℃變性30 s,50 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)結束后72 ℃延伸7 min[8]。不同的物種進行SRAP-PCR擴增的最優(yōu)

12、條件并非相同,因此在進行具體研究時應對PCR中反應體系進行優(yōu)化,對相關參數做濃度梯度研究以確定研究對象的最優(yōu)擴增條件,達到最好的反應效果[9]。 </p><p><b>　　1.3產物檢測 </b></p><p>　　擴增產物通常用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,也可用瓊脂糖檢測多態(tài)性。分離完畢后用放射自顯影方法、銀染方法或EB方法檢測[8]。 </p&g

13、t;<p>　　2SRAP技術在農作物遺傳育種中的應用 </p><p>　　近年來,由于SRAP引物的大量開發(fā),并且在分子標記輔助育種中體現出了優(yōu)于AFLP、ISSR、RAPD等特點[10-11],因此備受遺傳育種學家的青睞,被廣泛應用于農作物遺傳多樣性評價、遺傳圖譜構建和品種鑒定等方面。 </p><p>　　2.1遺傳多樣性研究 </p><p>

14、;　　遺傳多樣性是指物種中不同個體遺傳變異的總和。遺傳多樣性的研究是植物種質資源保護、品種改良和開發(fā)利用的基礎。分析種質資源的遺產多樣性,探討遺傳基礎和親緣關系,為種質資源的利用提供理論基礎。何鳳發(fā)等[12]隨機選用了27對SRAP引物對44份馬鈴薯(Solanum tubero-sum)資源進行遺傳多樣性分析,有23對引物可產生104條多態(tài)性條帶,平均每對引物產生4.5個多態(tài)性條帶,表明SRAP標記有較高的多態(tài)性比率,多態(tài)性豐富,可用

15、于馬鈴薯遺傳多樣性的分析。李曉慧等[13]采用SRAP分子標記對西瓜(Citrullus lanatus)進行遺傳多樣性分析,8對引物組合共產生多態(tài)性條帶37條,平均4.7條,每對引物平均多態(tài)性比率為28.675%,結果表明SRAP標記具有較高的多態(tài)性,適合于分析西瓜等遺傳差異小的物種。 </p><p><b>　　2.2標定基因 </b></p><p>　　標定

16、基因對于后基因組學的研究和作物育種具有重要意義。育種工作的目的就是實現品種改良,品種改良的實質就是對目的基因進行選擇并實現優(yōu)異基因集成的過程。因而實現目的基因的快速定位、提高其選擇效率,是加快育種進程的關鍵。農作物的一些重要性狀都是由一個或多個基因決定的。如果能夠找到與目的性狀相關聯(lián)的基因或是找到與目的基因連鎖的分子標記,在雜交育種時就可以有目的地選擇親本,并且對于子代可以快速地鑒定,提高育種效率。在甘藍型油菜(Brassica nap

17、us)的育種過程中,選擇黃色籽粒是一個重要的任務。Fu等[14]利用SRAP分子標記對在不同環(huán)境中生長的2個重組品系的雜交品種進行分析,發(fā)現了19個數量相關性狀基因,其中一個主要的基因與標記EM11ME20/200相鄰,通過比較基因組學分析發(fā)現這個重要的QTL基因兩側的標記序列與擬南芥第5條染色體中定位于At5g44440基因和At5g49640基因間的一個重要的QTL基因的兩側序列有高度的同源性。 </p><p&

18、gt;　　產量性狀是復雜的數量性狀,對油菜產量性狀進行分析,可確定其在染色體上的位置及其遺傳效應,可以探討油菜雜種優(yōu)勢產生原因,提高育種中對產量性狀優(yōu)良基因型選擇的效率。Chen等[15]對油菜的雙單倍體群體和F2群體進行SRAP分析,發(fā)現了與6個生產性狀相關的QTL基因,包括植株高度、最低有效分枝的高度、主花序長度、角果長度、有效分枝數和角果密度,在某些染色體的區(qū)域中有多個性狀的QTL,與觀察到的部分表型性狀的相關性是一致的,表明QT

19、Ls的緊密連鎖是相關性遺傳的基礎。燕麥是人們常用的谷物,但是現在在谷物生長的土壤中經常會含有一些重金屬物質,如鎘。鎘是非必需的重金屬,在低濃度時對細胞就是高毒性的,而植物自身有一套機制可以負責鎘的解毒,并控制鎘的含量,但是對于同一種植物的不同品種可能由于遺傳因素的原因,它們的鎘含量是有差異的,因此培育低鎘含量的植物是育種的重要目標,試圖找到與低鎘含量連鎖的分子標記,作為表型選擇的依據。在對燕麥(Avena sativa)的分析中運用混合

20、群分離分析,發(fā)現了4個與鎘含量相關的分子標記:1個SRAP,2個RAPDs,1個REMAP,這4個標記同屬于一個連鎖群,代表著與谷</p><p>　　2.3構建遺傳圖譜 </p><p>　　遺傳圖譜是確定基因或DNA標志在染色體上的相對位置和遺傳距離,是研究基因組遺傳與變異的重要手段。衡量遺傳圖譜質量的一個重要標準是標記分布的均勻程度,而標記類型是影響連鎖群上的標記均勻分布與否的重要因

21、素之一。李媛媛等[17]利用SRAP、SSR和AFLP 3種分子標記技術對甘藍型油菜進行遺傳分析,構建了1張包含21個連鎖群的遺傳圖譜,其中涉及137個SRAP標記、143個SSR標記和118個AFLP標記,圖譜長1949.8 cM。在此研究中,雖然SSR和SRAP標記在圖譜上呈間隔分布,并且在所有21條連鎖群上,僅N7連鎖群上的標記分布不均勻,但SSR標記僅分布于非編碼區(qū),并且開發(fā)費時費力;AFLP標記與SRAP標記相比,AFLP標記

22、操作復雜,需要經過酶切、連接等步驟,成本較高,并且AFLP容易密集分布,在研究中約有1/2的AFLP標記僅分布在4條連鎖群上。因此,相比之下SRAP更適合于圖譜構建。Sun等[18]利用1 634對SRAP引物組合對雙單倍體甘藍型油菜群體作圖,共產生了13 551條SRAP條帶,構建的遺傳圖譜中基本上每1 cM就有8.45個SRAPs,比物理圖譜中每100 k</p><p><b>　　2.4品種鑒定

23、 </b></p><p>　　由于育種工作的大力推廣與開展,幾乎每個農作物中都培育了很多品種,有些品種從形態(tài)上看較為相似,并且也存在同物不同名的現象。為了有效地區(qū)分這些品種就必須建立分子鑒別機制。王燕等[19]利用15個引物組合對番茄(Cyphomandra betacea)11個主要品種以及1個近緣野生種進行種質鑒定的SRAP分析,雙引物組合me8/em8-1與me6-1/em14-1可以區(qū)分所有

24、供試材料,表明SRAP可有效用于番茄品種資源鑒定。Hao等[20]利用24對SRAP引物組合對芍藥屬(Paeonia)的29份栽培品種進行研究,這29份品種分別屬于不同組,有14個為芍藥組植株,有13個為牡丹組植株,還有2個芍藥組和牡丹組的雜交植株,擴增共產生了197條帶,其中187條多態(tài)性條帶。擴增條帶結果顯示,用獨特的擴增條帶和特殊的引物組合鑒定芍藥栽培品種是有效的,可以用35條SRAP條帶把14個芍藥栽培品種兩兩相互區(qū)分,并且還通

25、過Me8/Em8和Me8/Em1這2對引物組合把芍藥和牡丹樣品全部分離。 </p><p><b>　　3展望 </b></p><p>　　綜上可以看出,SRAP標記已被應用到農作物研究的很多領域,是一種簡單有效的分子標記。與其他分子標記相比,由于SRAP標記擴增對象是基因組中的開放閱讀框,可以體現開放閱讀框區(qū)域的多態(tài)性,也可更好地解釋物種性(下轉第82頁) <

26、;/p><p><b>　　(上接第80頁) </b></p><p>　　狀差異的原因。對研究中獲得的SRAP差異片段可以測序,把它轉化成SCAR(sequence characterized amplified region)標記,這將更加有利于種質資源的篩選鑒定工作?？傊?相信隨著檢測手段的精確度不斷提高和分析方法的逐步改進,SRAP標記會更加完善、更為廣泛地用于物

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