曼氏無針烏賊的染色體研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　曼氏無針烏賊的染色體研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物技術(shù)

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料與方法1</b></p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p><b>　　2.2方法2</b></p><p>　　2.2.1染色

4、體標(biāo)本的制備-------------------------------------------------------------------------------------2</p><p>　　2.2.2不同取材試驗(yàn)-------------------------------------------------------------------------------------------2&l

5、t;/p><p>　　2.2.3PHA的處理試驗(yàn)----------------------------------------------------------------------------------------2</p><p>　　2.2.4 不同濃度秋水仙素及處理時(shí)間試驗(yàn)-----------------------------------------------------

6、----------2</p><p>　　2.2.5不同濃度低滲及處理時(shí)間試驗(yàn)----------------------------------------------------------------------2</p><p>　　2.2.6染色體計(jì)數(shù)和核型分析-----------------------------------------------------------

7、--------------------2</p><p><b>　　3結(jié)果與分析3</b></p><p>　　3.1.材料對染色體的影響3</p><p>　　3.2PHA的處理對染色體的影響3</p><p>　　3.3秋水仙素濃度及處理時(shí)間對染色體的影響3</p><p>　　3

8、.4低滲液濃度處理時(shí)間對染色體的影響3</p><p>　　3.5染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)4</p><p>　　3.6染色體分析4</p><p><b>　　4討論8</b></p><p>　　4.1取材對染色體的影響8</p><p>　　4.2秋水仙素對染色體的影響8</p&g

9、t;<p>　　4.3低滲對染色體得影響8</p><p>　　4.3染色體的組型比較8</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p>　　摘要：以曼氏無針烏賊不同發(fā)育階段的胚胎、幼體及成體為材料，對染色體制備方法中植物血細(xì)胞凝集素(p

10、hytohemagglutinin，PHA)的運(yùn)用，秋水仙素的處理濃度與時(shí)間，低滲濃度與時(shí)間對染色體標(biāo)本分裂相的影響進(jìn)行了探討，并初步對其染色體進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，以囊胚期到原腸胚期的胚胎為材料，先0.6mg/mlPHA浸泡4個(gè)小時(shí)，之后用0.04%秋水仙素浸泡50min，0.05mol/L的KCL低滲處理60min，得到相對比較良好的分裂相。曼氏無針烏賊染色體數(shù)目為2n=82，n=41。經(jīng)初步核型分析顯示，曼氏無針烏賊有14對（第1

11、～14號）中部著絲粒染色體（m）、6對（第15～20號）亞中部著絲粒染色體（sm）和21對（第21～41號）端部染色體（t），因此，曼氏無針烏賊的核型為2n=82=28m+12sm+42m,染色體臂數(shù)NF=122條。染色體數(shù)目較其他軟體動(dòng)物多，另外端部染色體所占比例比較大，為51.22%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：曼氏無針烏賊；染色體；秋水仙素；低滲；核型</p><p>　　Abst

12、ract: Different development stage embryo, young and adult of Sepiella maindroni was used as materials in this experiment. The infact of PHA,colchicines on density and time, low permeating to chromosome specimens Split ph

13、ase were tested. And preliminary analyzed on the chromosomes. The result shows the best methods was use from blastul to gastrula as material,with the 0.6mg/ml PHA immerse for 4 hour ,then steep to 0.04% colchicines solut

14、ion in 50 min, at last low permeability for 60 min, whic</p><p>　　Keyword: Sepiella maindroni; chromosome; colchicines; low permeability; karyotype</p><p><b>　　1引言</b></p><

15、;p>　　染色體的研究是對一個(gè)物種體細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目、形態(tài)和長度等情況進(jìn)行研究，是細(xì)胞遺傳學(xué)的基本內(nèi)容。研究物種的染色體不僅有助于探討物種在分類系統(tǒng)中的地位和系統(tǒng)演化過程，而且對現(xiàn)代分子生物學(xué)研究和遺傳育種等都具有十分重要的意義。染色體組型的觀察、分析，并逐步建立了較為可靠的軟體動(dòng)物染色體制備方法，旨為解決分類學(xué)上的疑難問題提供更科學(xué)的依據(jù)，并為細(xì)胞的融合、人工誘導(dǎo)多倍體，遺傳圖譜等遺傳育種工作和遺傳多樣性的研究提供基礎(chǔ)資料。&l

16、t;/p><p>　　目前有關(guān)于染色體研究方面的報(bào)道較多，大多集中在魚類及節(jié)肢動(dòng)物，周麗青等對波紋唇魚（Cheilinus undulatus）染色體的制備及核型進(jìn)行了研究，得出波紋唇魚二倍體染色體數(shù)目2n=48,核型為2n=4M+10SM+32ST+2T[1]，舒琥等對長鰭籃子魚(Siganus canaliculatus)的染色體組型的研究表明長鰭籃子魚具有染色體48條，其核型公式為：2n=48，48t，臂數(shù)：N

17、F=48，未發(fā)現(xiàn)隨體、次縊痕和異型性染色體[2]；周嶺華等以精巢、胚胎及無節(jié)幼體為材料研究了鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）染色體的數(shù)目及核型,染色體數(shù)目為2n=70,n=35.核型公式為2n=70=42M+10SM+12ST+6T[3]；朱冬發(fā)等研究了三疣梭子蟹的核型，得出三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）核型為2n=106=40m+6sm+60t[4]。有關(guān)軟體動(dòng)物染色體主要

18、有：文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)核型為2n=38=18m+20sm,NF=76（常建波）[5]；皺紋盤鮑（Haliotis dis</p><p>　　曼氏無針烏賊（Sepiella maindroni），俗稱墨魚、血墨，是我國重要的海洋頭足類經(jīng)濟(jì)漁業(yè)資源，在中國海洋資源產(chǎn)量中占有重要的位置。隸屬于軟體動(dòng)物門、頭足綱、二鰓亞綱、十腕目、烏賊科、無針烏賊屬，為我國沿海廣溫廣布種。曼氏

19、無針烏賊曾被譽(yù)為東海區(qū)四大漁業(yè)之一，但80年代后期開始，該種資源明顯衰退，產(chǎn)量急劇下降，目前數(shù)目甚少，僅作為兼捕對象，對其資源的保護(hù)已迫在眉睫[10,11,12]。曼氏無針烏賊由于具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而為人們所熟知，其本身不僅具有營養(yǎng)價(jià)值高、生活周期短、生長快等特點(diǎn)，其生物學(xué)意義以及科研價(jià)值也越來越為人們重視。</p><p>　　曼氏無針烏賊作為我國東海重要資源，近年來對于曼氏無針烏賊的相關(guān)報(bào)道也日趨增多。這些研

20、究主要集中生態(tài)學(xué)[13,14,15]，形態(tài)學(xué)[16,17,18,19]，養(yǎng)殖學(xué)[20,21,22,23]等方面。而對于曼氏無針烏賊染色體的研究國內(nèi)外還沒有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以曼氏無針烏賊的胚胎為材料，并對染色體制備方法中秋水仙素的處理濃度與時(shí)間，低滲濃度與時(shí)間等對其染色體標(biāo)本分裂相的影響進(jìn)行了探討，并選取了相對分散較好的中期分裂相進(jìn)行了染色體粗略計(jì)數(shù)，分析了核型，以期為曼氏無針烏賊遺傳圖譜、育種等研究提供理論依據(jù)。</p>

21、<p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用材料為2010年7月至2010年11月之間采自浙江省寧海得水水產(chǎn)育苗廠養(yǎng)殖的曼氏無針烏賊不同發(fā)育階段的胚胎（室內(nèi)水泥池自然生產(chǎn)獲得），剛孵化出的幼體及成體。</p><p><b>　　

22、2.2方法</b></p><p>　　2.2.1染色體標(biāo)本的制備</p><p>　　取曼氏無針烏賊的胚胎剝?nèi)ネ獠亢谏珗?jiān)韌而富有彈性的三級卵膜、幼體及成體為材料，浸泡于0.6mg/ml的PHA溶液中一定時(shí)間（成體PHA注射），然后用秋水仙素處理樣品一段時(shí)間，除去卵黃，吹打散細(xì)胞，用低滲液低滲，然后用Carnoy液(甲醇∶冰乙酸= 3∶1)固定，離心，棄上清液，固定三次，滴片，

23、室溫干燥，用10%Giemsa染液染色20min，自來水沖洗，空氣干燥法干燥后鏡檢。</p><p>　　2.2.2不同取材試驗(yàn)</p><p>　　分別取曼氏無針烏賊受精卵期，囊胚期，原腸胚期等不同發(fā)育階段的胚胎，剛孵化出的幼體，浸泡于0.6mg/ml的PHA溶液中4h，成體按25µg/g的標(biāo)準(zhǔn)注射PHA，12h后再注射一次，取精巢、腎等組織，之后0.04%的秋水仙素處理50m

24、in，0.05mol/LKCL溶液低滲處理60min，各三平行。其他步驟參考2.2.1。.</p><p>　　2.2.3PHA的處理試驗(yàn)</p><p>　　采用囊胚期到原腸胚期的胚胎為材料，浸泡于0.6mg/ml的PHA溶液中4h，對照組不對其進(jìn)行PHA浸泡，之后用0.04%的秋水仙素處理50min，0.05mol/LKCL溶液低滲處理60min，各三平行。其他步驟參考2.2.1。&l

25、t;/p><p>　　2.2.4 不同濃度秋水仙素及處理時(shí)間試驗(yàn)</p><p>　　采用囊胚期到原腸胚期的胚胎為材料，秋水仙素濃度分別為0.01%，0.02%,0.03%，0.04%，0.05%，0.06%，0.1%，0.2%，0.3%。時(shí)間為30min,40min, 50min ,60min,70min，80min，90min，浸泡于0.6mg/ml的PHA溶液中4h ，0.05mol/L

26、KCL溶液低滲處理60min，各三平行。其他步驟參考2.2.1。</p><p>　　2.2.5不同濃度低滲及處理時(shí)間試驗(yàn)</p><p>　　采用囊胚期到原腸胚期的胚胎為材料，低滲液濃度分別為50%海水，25%海水，12.5%海水，0.075mol/L KCL,0.05mol/L KCL,0.025mol/L KCL，時(shí)間為40min，50min，60min，70min，80min，90

27、min，100min，浸泡于0.6mg/ml的PHA溶液中4h ,0.04%的秋水仙素處理50min，各三平行。其他步驟參考2.2.1。</p><p>　　2.2.6染色體計(jì)數(shù)和核型分析</p><p>　　用Olympus BX-60熒光顯微鏡對染色體標(biāo)本進(jìn)行觀察，對不同條件處理下的分裂相細(xì)胞進(jìn)行顯微攝影，并選取分散相相對較好的，染色體形態(tài)相對來說較容易辨認(rèn)的中期分裂相進(jìn)行著重顯微攝影

28、。選取染色體分散較好的底片經(jīng)幻燈機(jī)投影到白紙上進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。其中適于做核型分析的中期相用鉛筆在白紙上勾畫出染色體的形態(tài),染色體形態(tài)的分類標(biāo)準(zhǔn)按照Levan[24]等的分類標(biāo)準(zhǔn)。臂比指數(shù)在1.0～1.7之間的稱為中央著絲粒染色體（M）；在1.7～3.0之間的稱為亞中部著絲粒染色體（SM）；3.0～7.0為亞端部著絲粒染色體（ST），著絲粒指數(shù)大于7.0的為端部著絲粒染色體（T）。染色體相對長度計(jì)算公式如下：</p><

29、;p>　　染色體相對長度=(實(shí)測長度/全部染色體長度總和)×100</p><p><b>　　3結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1材料對染色體的影響</p><p>　　經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，材料的選取直接影響到染色體標(biāo)本的質(zhì)量。以囊胚期和原腸胚期的處理較為理想（表1）。</p><p>　　3

30、.2 PHA的處理對染色體的影響</p><p>　　通過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.6mg/ml的PHA溶液中浸泡4h，之后所制作成的染色體標(biāo)本，分裂相明顯較沒有處理過的增多（圖3）。</p><p>　　3.3秋水仙素濃度及處理時(shí)間對染色體的影響</p><p>　　秋水仙素的處理是染色體標(biāo)本制作中的關(guān)鍵，對結(jié)果起關(guān)鍵作用。通過多次實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)，0.04%的秋水仙素，時(shí)間

31、50min，達(dá)到的效果相對來說比較理想(表2)。</p><p>　　3.4低滲液濃度處理時(shí)間對染色體的影響</p><p>　　低滲是實(shí)驗(yàn)過程中另一重要的處理?xiàng)l件，多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.05mol/LKCL溶液低滲處理60min，得到的分裂相相對比較理想。濃度過低，時(shí)間過短，細(xì)胞沒有膨脹；濃度過高，時(shí)間過長，細(xì)胞破碎嚴(yán)重，沒有完整的分裂相（表3）。</p><p>　

32、　表1 不同材料對染色體的影響</p><p>　　Tab.1 The infact of different materials on the chromosomes</p><p>　　注：- 表示不理想；+ 表示較理想。</p><p>　　Note: - undesirability; + desirability</p><p>　

33、　表2 秋水仙素對染色體的影響</p><p>　　Tab.2 the infact of l colchicines on the chromosomes</p><p>　　注：- 表示未見染色體；+ 表示分散不太好；++ 表示分散較好。</p><p>　　Note: show not see chromosomes; + show not very good

34、 scattered ; + + show better scattered </p><p>　　表3低滲溶液對染色體的影響</p><p>　　Tab.3 the infact of low permeability on the chromosomes</p><p>　　注：- 表示未見染色體；+ 表示分散不太好；++ 表示分散較好。</p>

35、<p>　　Note: show not see chromosomes; + show not very good scattered ; + + show better scattered </p><p>　　3.5染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)</p><p>　　在顯微鏡下對曼氏無針烏賊分散較好的28個(gè)染色體中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)。觀察結(jié)果表明，染色體為82條的分裂相最多，為11個(gè)，出現(xiàn)

36、的百分比率為39.26%，而80條的為5個(gè)，所占的百分比率為17.86%，多于82條的僅為2個(gè)，所占的百分比率為17.14%，曼氏無針烏賊的中期分裂相為二倍體，其染色體數(shù)目為2n=82（表4）。非眾數(shù)部分的染色體數(shù)目可能是由細(xì)胞制片過程中的誤差所造成的。</p><p>　　表4 胚胎細(xì)胞分裂中期染色體數(shù)出現(xiàn)頻率</p><p>　　Tab.4　Frequency of chromosom

37、al number of somatic cells from embryos</p><p><b>　　3.6染色體分析</b></p><p>　　對實(shí)驗(yàn)所得圖片進(jìn)行染色體的顯微測量、分析，根據(jù)臂比和相對長度進(jìn)行同源染色體配對，曼氏無針烏賊全部染色體配成41對（圖1）。計(jì)算出染色體相對長度和著絲粒指數(shù)的變化范圍分別為0.86%～4.57%和0～45.90(表5)

38、。據(jù)Levan等的染色體分類標(biāo)準(zhǔn)對曼氏無針烏賊的染色體核型進(jìn)行了初步的分析：具中部著絲粒染色體（M）有14對，亞中部著絲粒染色體（SM）有6對，端部著絲粒染色體21對（圖2）。核型公式：2n=82=28m+12sm+42t。染色體臂數(shù)：NF=122條。</p><p>　　圖1　曼氏無針烏賊細(xì)胞分裂中期染色體顯微圖相</p><p>　　Fig.1　The micrograph of me

39、taphase chromosomes in Sepiella maindroni</p><p>　　圖2　曼氏無針烏賊核型</p><p>　　Fig.2　Karyotype of Sepiella maindroni</p><p>　　圖3 PHA對染色體制片的影響</p><p>　　Fig.3 The effect of PHA

40、 on the chromosomes</p><p>　　注：A、PHA未處理的細(xì)胞；B、經(jīng)PHA處理的細(xì)胞</p><p>　　Note: A、PHA unprocessed cells; B、PHA processed cells</p><p>　　圖4兩種類型的染色體</p><p>　　Fig.4 two kind of chr

41、omosomes</p><p>　　注：A、B、C、X型染色體；D、桿狀染色體</p><p>　　Note: A、B、C、X chromosome; D、Lever chromosome</p><p>　　表5　曼氏無針烏賊核型指數(shù)</p><p>　　Tab.5　Indices of karyotype in Sepiella mai

42、ndroni</p><p>　　注: M為中部著絲粒染色體; SM為亞中部著絲粒染色體; T為端部著絲粒染色體</p><p>　　Note：M for the metacentric chromosomes;SM for the submetacentric chromosomes;T for the telocentric chromosomes</p><p&g

43、t;<b>　　4討論</b></p><p>　　4.1取材對染色體的影響</p><p>　　材料是影響軟體動(dòng)物染色體制片中一個(gè)重要的因素，海產(chǎn)軟體動(dòng)物一般選取腮，生殖腺，各期幼蟲或胚胎等作為染色體標(biāo)本制作的材料，三疣梭子蟹以胚胎，生殖腺，幼體作為材料[4]；硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）染色體標(biāo)本制作選取4-8細(xì)胞期的胚胎為材料[19]；巖

44、牡蠣(Crassostrea nippona)染色體標(biāo)本的制作用面盤幼蟲作為核型的材料[26]，Papan等用血液細(xì)胞培養(yǎng)法得到虎斑烏賊的染色體數(shù)目[9]，但是這種材料選擇有一定技術(shù)上的難度。作者在實(shí)驗(yàn)過程中，通過成體取腮及生殖腺的方法多次嘗試，但由于試驗(yàn)前需要活體注射PHA，容易使烏賊受刺激而噴墨，對烏賊產(chǎn)生毒害而死亡，很難取到活體腮及生殖腺等材料。采用剛孵化出的幼體作為染色體標(biāo)本制作的材料效果也不太理想，主要是沒有得到過分裂相的細(xì)胞

45、，可能是因?yàn)閯偡趸龅臑踬\分裂不是很旺盛，之后在加入PHA海水中浸泡也有過嘗試，但還是沒有得到理想的效果。又由于烏賊沒有幼蟲期，而其處于胚胎期的時(shí)間比較長，在19℃水溫下，從受精卵到孵化出膜可以維持28～30d。受精卵期的細(xì)胞分裂比較旺盛，但是這段時(shí)期的胚胎卵黃不容易去除，影響到染色體標(biāo)</p><p>　　4.2秋水仙素對染色體的影響</p><p>　　秋水仙素的處理濃度和時(shí)間是染色體

46、標(biāo)本制作過程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟，秋水仙素是劇毒物質(zhì)，能抑制細(xì)胞有絲分裂,使有絲分裂停止于分裂中期,但是在使用劑量及作用時(shí)間上難以把握,而且有毒藥物的使用可能導(dǎo)致染色體過分濃縮、扭曲甚至變形，陸榮茂等對小莢蟶的染色體制作采用0.01%的秋水仙素浸泡30min[8]；寬殼全海筍的處理也是用0.01%浸泡30min[25]；而櫛孔扇貝活體取腮采用0.04%的秋水仙素浸泡[27]；硬殼蛤的處理采用0.05%秋水仙素浸泡[31]。而在本次的實(shí)驗(yàn)中，

47、通過前期的多次試驗(yàn)之后最后采用胚胎去除膜之后0.04%秋水仙素浸泡，操作過程相對比較容易掌控，得到的結(jié)果相對比較好。</p><p>　　4.3低滲對染色體得影響</p><p>　　在本次實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行過程中，對低滲液濃度選取和低滲時(shí)間的作了大量的探索，因?yàn)橹苯佑绊懙郊?xì)胞的膨脹程度，染色體標(biāo)本的分散的好壞，一般的軟體動(dòng)物的染色體標(biāo)本制作低滲采用0.037 mol/L～0.075mol/L

48、KCL溶液，處理時(shí)間為30～50min[7,26,30]，也有采用20%～50%的海水[6,8,30,31]。在實(shí)驗(yàn)前期，一直采用KCL溶液，濃度及處理時(shí)間不等，但是始終沒有得到很好的效果，在多次實(shí)驗(yàn)嘗試之后，最后用0.05mol/LKCL溶液低滲處理60min之后達(dá)到的效果相對較為理想。</p><p>　　4.4 染色體的組型比較</p><p>　　關(guān)于軟體動(dòng)物的染色體研究上個(gè)世紀(jì)開

49、始陸續(xù)有報(bào)道，染色體數(shù)目也相差比較大，雙殼綱二倍體的染色體數(shù)目為14 條~48條，多板綱為12 條~26條。而頭足綱的染色體數(shù)目一般比較多，虎斑烏賊染色體數(shù)目為48條[9]，章魚（Octopus vulgaris）的染色體數(shù)目為2n=56[32]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)曼氏無針烏賊的染色體條數(shù)為2n=82，與其他的烏賊有一定的差距，一般染色體數(shù)相同說明親緣關(guān)系較近，但是由于本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支撐，還無法確定其與其他物種的親緣關(guān)系。另外在本次

50、實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的過程中，出現(xiàn)了兩種曼氏無針烏賊的染色體形態(tài)，接近桿狀的和X型的（ 圖4），很可能是由于材料的選取，以及后期PHA和有毒物質(zhì)秋水仙素處理導(dǎo)致染色體濃縮，變形。對于核型分析來講X型的是較為理想的，但是由于在此次實(shí)驗(yàn)中所得到的染色體標(biāo)本分散不是很好，另外此種類型得到的中期分裂相不是很多，很難進(jìn)行計(jì)數(shù)和核型分析。又由于受原材料受季節(jié)的限制，無法進(jìn)一步的摸索。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)&

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