如何成功申請國家自然科學(xué)基金

1、如何成功申請國家自然科學(xué)基金,第一部分基金委面上項(xiàng)目評審基本程序及重要環(huán)節(jié),初 審： 由各學(xué)科處組織實(shí)施。 ①申請者不具備申請資格或違反有關(guān)規(guī)定； ②手續(xù)不完備或申請書不符合要求; ③內(nèi)容不符合資助范圍或超出資助能力; ④申請者以往資助項(xiàng)目執(zhí)行不利。,查 重：由基金委信息中心組織實(shí)施。 ① 高職申請與承擔(dān)（含參加）面上、

2、重點(diǎn)、重大 累計不超過3項(xiàng)； ② 在職研究生不作為限項(xiàng)申請的條件但只可申請 面上項(xiàng)目； ③ 申請者同期只能申請一項(xiàng)，每個項(xiàng)目申請者限 為一人; ④ 高職申請者當(dāng)年申請及承擔(dān)的在研面上項(xiàng)目累 計不超過兩項(xiàng); ⑤ 不具有高職的申請者申請及負(fù)責(zé)的在研面上項(xiàng) 目不超過一項(xiàng); ⑥ 青年基金只能獲得一項(xiàng)資助

3、。,同行評議（一審）： 由基金委各學(xué)科處組織實(shí)施?；境绦颍?每份申請書選擇同行評議專家（5位）； 函請同行評議：對項(xiàng)目進(jìn)行定性定量評價； 收回評議卡；對定量部分進(jìn)行計算機(jī)判讀、打分、排序； 據(jù)學(xué)科資助項(xiàng)目數(shù)130％確定第二輪評審項(xiàng)目。,專家評審組或?qū)I(yè)委員會評審（二審）。 主要對一審?fù)扑]項(xiàng)目進(jìn)行評議，篩除 30％。 再次對二審會確定資助項(xiàng)目進(jìn)行審查： 進(jìn)一步查重；

4、 以往承擔(dān)項(xiàng)目是否按期完成； 是否有違反基金委有關(guān)申請規(guī)定。 基金委員會委務(wù)會審議。 下發(fā)批準(zhǔn)、未批準(zhǔn)通知。,第二部分 如何撰寫國家自然科學(xué)基金申請書,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義等,如：“用……方法（手段）進(jìn)行……研究，探索/證明……問題，對闡明……機(jī)制／ 揭示……規(guī)律有重要意義，為……奠定基礎(chǔ)／提供……思路 ”,,采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年

5、性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細(xì)胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,二、立論依據(jù)對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項(xiàng)目科學(xué)意義 對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中的重要科技問題論

6、述其應(yīng)用前景,,在研究領(lǐng)域（疾病防治）層面,從研究方向展開,圍繞本項(xiàng)目擬解決的問題進(jìn)行歸納分析,提出設(shè)想,從研究領(lǐng)域（疾病防治）切入,,,,,,,研究意義,立論依據(jù),1、項(xiàng)目的研究意義 存在問題：對科學(xué)意義闡述不足或夸大。 撰寫方法：從疾病入手，簡述其特點(diǎn)、危害，目前主要的治療方法及其存在的問題。 簡要分析該病發(fā)病機(jī)理和主要研究熱點(diǎn)，引出目前存在的主要問題，也就是本項(xiàng)目要解決的問題，以此為切入點(diǎn)提出

7、假設(shè)，闡述如果實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，對該病甚至相關(guān)疾病的預(yù)防、治療具有的理論意義和臨床價值。,老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類第一位的致盲疾病。迄今為止,治療白內(nèi)障唯一有效的方法是通過手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花費(fèi)的資金已成為世界各

8、國包括富裕的發(fā)達(dá)國家嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病時間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會減少45%[1]。所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑征服白內(nèi)障已成為一項(xiàng)全球性的社會和社會經(jīng)濟(jì)問題[2]。,但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)晶狀體上皮細(xì)胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對其中進(jìn)一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)

9、胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點(diǎn)，以晶狀體上皮細(xì)胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達(dá)的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對其功能進(jìn)行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（綜述） 存在問題： 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)不夠，

10、對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解， 提出的問題別人已解決---低水平重復(fù)。 對研究方法不熟悉，簡單移植或夸大其作用， 缺乏實(shí)際應(yīng)用的可行性---無法實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。 ---已有方法與掌握方法的人的結(jié)合； ---方法理論上可行與現(xiàn)實(shí)可行性的結(jié)合。 對國內(nèi)外現(xiàn)狀只是簡單羅列，缺乏歸納分析， 缺乏邏輯性和針對性---總結(jié)與表達(dá)不夠。,,,(,撰寫方法

11、：要緊緊圍繞本次申請項(xiàng)目的主題。 1、從疾病切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果，并引出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。 2、從研究方向展開，較詳細(xì)地分析國內(nèi)外在本方向的研究進(jìn)展，引出闡明疾病發(fā)病機(jī)理或發(fā)明新的治療方法的關(guān)鍵問題所在。 3、圍繞關(guān)鍵問題，詳細(xì)論述國內(nèi)外以往的研究結(jié)果、當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢。綜合分析后提出目前尚未解決的問題。,4、對擬采用的技術(shù)方法進(jìn)行介紹和分析。 成

12、熟的方法要簡要介紹，重點(diǎn)闡明可以應(yīng)用于本研究的依據(jù)。 新方法要詳細(xì)介紹其原理，并闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 要特別注意的問題：必須對項(xiàng)目中所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程及在實(shí)際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。 例如：單鏈抗體+功能基團(tuán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合，但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化”等問題。 5、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。,,,,防治白內(nèi)障必須針對其

13、發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細(xì)胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。,因?yàn)榫铙w上皮細(xì)胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀

14、體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細(xì)胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異[3-5] 。,體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)多種因素(H2O2、UV-B、晶狀體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶

15、狀體混濁的主要環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。,白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性多種基因表達(dá)的改變。目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要

16、以下三方面：,一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達(dá)增加；還有組蛋白H4、H3 的低表達(dá)`和蛋白酶C、β-肌動蛋白、γ-肌動蛋白基因的高表達(dá)[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase

17、 chain reaction differential display)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細(xì)胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少以及細(xì)胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、β-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達(dá)的增加。,二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基因（vimentin）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表

18、現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]報告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白α3（α3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目

19、前尚缺乏進(jìn)一步的報告。,三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達(dá)有差異。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個高表達(dá)基因和12個低表達(dá)的基因。但就DD-PCR技術(shù)

20、來講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長cDNA的問題。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 尋找白內(nèi)障時晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。,尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（subtractive hybridization, SH），它是……，但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。 經(jīng)過

21、改進(jìn)后的抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……簡化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問題很多。 我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)[19，20]，其特點(diǎn)是：簡便易行，能夠獲得目的細(xì)胞特異表達(dá)的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。,該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)

22、的基因，其中5個為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長cDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。,基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效。基因芯片是在1996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補(bǔ)原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)

23、記雜交體，經(jīng)自動閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對檢測基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。,由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測多個樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我

24、們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。,綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。,注意事項(xiàng),注意邏輯

25、性和層次感，并隨時點(diǎn)題。 文字表達(dá)要精雕細(xì)琢，避免假大空。 參考文獻(xiàn)必須提供作者全名、出處。 參考文獻(xiàn)必須引用02年甚至03年的文獻(xiàn)。 要注意參考國內(nèi)相關(guān)專業(yè)知名專家的論著。 文獻(xiàn)回顧不能回避國內(nèi)外最新研究進(jìn)展。,,,,,,,三、研究方案,1、研究目標(biāo) 存在問題： 目標(biāo)過大 撰寫要求： 有限目標(biāo)，與研究內(nèi)容相呼應(yīng),如：探索……問題，明確……關(guān)系，

26、揭示……規(guī)律， 闡明……原理（機(jī)制），建立……方法等,研究目標(biāo)： 篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，為防治白內(nèi)障提供線索。,,2、研究內(nèi)容： 存在問題：內(nèi)容過多，一個研究周期難以完成；內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)。 撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)，確保研究周期內(nèi)完成；與目標(biāo)相輔相成，為研究目標(biāo)服務(wù)。篇幅要適度，注

27、意與技術(shù)路線區(qū)別。 確定研究目標(biāo)、內(nèi)容的依據(jù)：回答一個科學(xué)問題； 根據(jù)研究周期、資助強(qiáng)度來確定。,研究內(nèi)容： （1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達(dá)基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。,（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的

28、結(jié)構(gòu)：對白內(nèi)障 相關(guān)基因cDNA進(jìn)行特異擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的克隆、 鑒定，測定基因序列，分析基因的結(jié)構(gòu)，獲得全長 基因。 （3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞 變化中的作用：利用反轉(zhuǎn)錄病毒，對培養(yǎng)的人晶狀 體上皮細(xì)胞和在體小鼠晶狀體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，觀察 白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)铙w上皮細(xì)胞的影響以及在白 內(nèi)障形成中的作用。,觀察指標(biāo)如下：①存活細(xì)胞數(shù)；②光鏡、透射

29、 電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化；③細(xì)胞凋亡檢測：用原位 末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA 水平分析細(xì)胞凋亡；④細(xì)胞增殖的檢測：用免疫組 織化學(xué)的方法檢測核蛋白Ki-67；⑤細(xì)胞骨架蛋白 （Vimentin、Actin）的檢測：用Northern雜交 法檢測vimentin 、actin mRNA的表達(dá)，用SDS- PAGE及Western blot方法檢測波形纖維蛋白、肌

30、 動蛋白（均為尿素溶性蛋白）；⑥晶狀體蛋白的檢 測：用SDS-PAGE方法觀察水溶性蛋白α、β、γ 晶狀體蛋白的變化。,3、擬解決的關(guān)鍵問題： 存在問題：未能抓住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。 撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，寫出解決辦法。 什么是關(guān)鍵問題 ？ --研究過程中對達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的 某些研究內(nèi)容或因素。

31、 --為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或 研究手段。,擬解決的關(guān)鍵問題： （1）建立差異表達(dá)的cDNA文庫： 建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。 為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案： ①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠 大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫的mRNA的來源。

32、 ②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表 達(dá)的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。,（2）制備基因芯片： 制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相 關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在 1平 方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不 使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時做到： ①嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行；②在標(biāo)

33、本的處理及RNA提 取時避免污染，否則即會造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán) 格按操作程序進(jìn)行操作就可以避免發(fā)生差錯。,（3）在體基因轉(zhuǎn)染： 在體基因轉(zhuǎn)染是進(jìn)行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。 在體的晶狀體上皮細(xì)胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細(xì)胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以上問題我

34、們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細(xì)胞的局限性，對分裂后細(xì)胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑1-2μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細(xì)胞。,4、研究方法 存在問題： 過于簡單：在實(shí)驗(yàn)方案中只有方法名稱而無具體步驟

35、。 過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。 撰寫要求：以研究項(xiàng)目的需求為前提，盡量采用目前 最先進(jìn)的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體 現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。,本課題主要利用改良消減雜交技術(shù)和基因 芯片技術(shù)篩選老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與 正常晶狀體上皮細(xì)胞有差異表達(dá)的基因，分析 其結(jié)構(gòu)，預(yù)測其功能，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)探討 其在晶狀體上皮細(xì)胞變化、白內(nèi)障形成中的作 用，從晶狀體上皮細(xì)胞

36、的角度揭示老年性白內(nèi) 障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。,5、技術(shù)路線 存在問題： 不清楚，不詳細(xì)。 撰寫要求： 清晰、詳細(xì)、注意邏輯性。 撰寫方法：以時間順序?yàn)橹骶€設(shè)計技術(shù)路線以研究內(nèi)容為主線設(shè)計技術(shù)路線分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。詳細(xì)地寫清楚每個具體步驟。,（1）人晶狀體上皮細(xì)胞的獲得：老年性白內(nèi)障 晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊 膜（晶狀

37、體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。 正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體， 在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻(xiàn)提供 的方法去除晶狀體纖維細(xì)胞，仔細(xì)清洗以去除血細(xì) 胞污染。 （2）建立差異cDNA文庫：從50例白內(nèi)障手術(shù) 患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞 作為對照組，利用改良的消減

38、雜交技術(shù)[19，20]， 獲得差異表達(dá)的cDNA，并建立文庫。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下：,正常晶狀體上皮細(xì)胞 白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞 Promega PolyATtract® System 1000 mRNA分離 mRNA分離oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄 ntech Cap-finder方法反轉(zhuǎn)錄

39、 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 隨機(jī)引物PCR 雜交

40、 Sephacryl S-400柱,,,,,,,,,,,,除鹽及小片段 鏈親和素-生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細(xì)胞cDNA “長距離”PCR 目的cDNA的特異擴(kuò)增 克隆、鑒

41、定、轉(zhuǎn)化 建立差異基因文庫,,,,,（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： ① 基因芯片的制備： ……… ②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：取10例正常晶狀體前囊膜上的晶狀體上皮細(xì)胞為對照組。分次取老年性白內(nèi)障前囊膜200例，分成20組，每組10例，取上皮細(xì)胞。提取上皮細(xì)胞中總RNA，分離純化mRNA。采用RT-PCR技術(shù)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并用熒光標(biāo)記，根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法（Schena M.

42、 et al Science 1995,170:467）進(jìn)行雜交。雜交后用氬離子束激發(fā)熒光標(biāo)志，經(jīng)閱讀器識別、計算機(jī)分析，獲得雜交的定量結(jié)果。統(tǒng)計20次每個cDNA片段的雜交陽性率和強(qiáng)度，確定篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出可能與白內(nèi)障關(guān)系密切的基因片段。,(4) 白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： ① 序列測定：... ... ② 序列的計算機(jī)分析： ... ... a.基因片段的同源性分析： ... .

43、.. b.氨基酸序列的同源性分析： ... ... c.基因序列的編碼區(qū)分析： ... ... d.局部組成復(fù)雜性分析： ... ... e.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析： ... ... ③ 獲得全長基因： ... ...,(5) 基因轉(zhuǎn)染： A、培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染： ① 存活細(xì)胞數(shù)：...... ②

44、細(xì)胞凋亡的檢測：...... ③ 細(xì)胞增殖的檢測：...... ④ 細(xì)胞骨架蛋白的檢測：...... ⑤ 晶狀體蛋白的檢測：...... B、在體晶狀體的轉(zhuǎn)染： ① 形態(tài)學(xué)觀察：...... ② 取晶體前囊膜，分離其下晶狀體纖維，作A中③-④項(xiàng)檢測。通過以上研究，分析白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)w上皮細(xì)胞的作用及與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系。,6、可行性分析 理論分析 研究

45、手段、方法分析 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 所用特殊實(shí)驗(yàn)材料（試劑）的分析 對所具備的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析 對項(xiàng)目組成員搭配及其運(yùn)用技術(shù)方法的能力分析,(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫： 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞是處在不同狀態(tài)下的細(xì)胞，細(xì)胞基因表達(dá)的改變 是細(xì)胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基 因是探索細(xì)胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口

46、。利用的 消減雜交技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。改良 的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用 此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表 達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其 中 5個為新基因，這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了該方法 的可操作性，而且我們在運(yùn)用此方法過程中也積累了 較豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，本研究利用這一方法從兩種狀 態(tài)的晶狀體上皮細(xì)胞中篩選差異表達(dá)的基因并建立

47、 cDNA文庫是可行的。,(2)關(guān)于制備基因芯片和篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： (3)關(guān)于白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： (4)關(guān)于在體基因轉(zhuǎn)染的可行性分析： 綜上所述，我們的研究方案從理論到實(shí)踐都是 可行的，實(shí)驗(yàn)中所涉及到的材料和試劑均為商品， 本校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室為全軍開放實(shí)驗(yàn)室、基因研究 所、中心實(shí)驗(yàn)室及本實(shí)驗(yàn)室具備完成該項(xiàng)研究的實(shí) 驗(yàn)條件，預(yù)計可以實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目的預(yù)期目標(biāo)。

48、,7、創(chuàng)新性 對創(chuàng)新的理解：創(chuàng)新性與先進(jìn)性是有根本區(qū)別的。 原始創(chuàng)新： 填補(bǔ)空白或修改傳統(tǒng)的理論； 新技術(shù)、新方法的發(fā)明創(chuàng)造。 跟蹤創(chuàng)新： 在前人工作基礎(chǔ)上補(bǔ)充、完善現(xiàn)有理論； 對原有技術(shù)、方法進(jìn)行修改后產(chǎn)生1＋1＞2的 效果。,（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新： 首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀 體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫，并制備相應(yīng)的基因 芯片，利用此基因芯片篩選老年性

49、白內(nèi)障相關(guān)基因。 這使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得白內(nèi)障 相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的 功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分 子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。 （2）基因功能研究上的創(chuàng)新：......,8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計劃： 按年度列出：研究內(nèi)容及其階段目標(biāo)；擬組織 的重要學(xué)術(shù)交流活動、國

50、際合作與交流計劃等。 預(yù)期研究結(jié)果： 理論成果：建立/豐富/補(bǔ)充/填補(bǔ) ...... 技術(shù)方法：建立/完善 …... 專 利：可望獲得 …… 論 文：國際、國內(nèi) 人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生,研究計劃及預(yù)測進(jìn)展： 2001.01-2001.12 ： （1）采用改良的消減雜交技術(shù)篩選

51、白內(nèi)障 晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞差異 表達(dá)的基因，建立cDNA文庫。 （2）制備白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá) 基因芯片。 2002.01-2002.12 ：...... 2003.01-2003.12 : ......,預(yù)期的研究成果 通過本項(xiàng)目的系統(tǒng)研究，有望闡明老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，從晶狀體上皮細(xì)胞的角度揭示

52、白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理，為白內(nèi)障防治提供理論依據(jù)。 研究成果以論文和科技進(jìn)步獎提供。預(yù)計在國際、國內(nèi)期刊上發(fā)表論文8-10篇。,四、研究基礎(chǔ)1、工作基礎(chǔ) 存在問題： 內(nèi)容過簡； 與申請項(xiàng)目無關(guān)。 撰寫要求： 要介紹與申請項(xiàng)目直接相關(guān)的研究結(jié)果； 提供有關(guān)的研究論文、成果及專利等材料； 以往應(yīng)用與申請項(xiàng)目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷。

53、 工作積累也要包括項(xiàng)目組成員的所有信息。,（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ): 本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜 交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的， 并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異 表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因， 其中5個為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：...... （2）有關(guān)基因轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)：......

54、 （3）有關(guān)老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)：......,2、工作條件 包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和 擬解決的途徑，包括利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開 放實(shí)驗(yàn)室的計劃與落實(shí)情況。 3、申請者及項(xiàng)目組成員簡歷 所有項(xiàng)目組成員的工作簡歷及發(fā)表相關(guān)論著均 應(yīng)介紹，尤其是要針對項(xiàng)目組成員的分工介紹研究 工作經(jīng)歷。,第三部分科 研 選 題,一、科

55、研選題的意義 愛因斯坦指出：“提出一個問題往往比解 決一個問題更重要，因?yàn)榻鉀Q一個問題也許僅 僅是一個數(shù)學(xué)上或?qū)嶒?yàn)上的技能而已。而提出 新的問題，新的可能性，以新的角度去看舊的 問題，卻需要創(chuàng)造性的想象力，而且標(biāo)志著科 學(xué)的真正進(jìn)步?！?選擇課題、確定主攻方向是科學(xué)研究中具 有戰(zhàn)略意義的首要問題。,二科研選題的原則 1、需要性原則：選擇有

56、重大意義或急需解決的問題。 2、目的性原則：目標(biāo)集中，不含糊，不籠統(tǒng)。 3、創(chuàng)新性原則：針對科學(xué)而言，沒有地域性。 4、先進(jìn)性原則：針對技術(shù)而言，有地域性。 5、科學(xué)性原則：有依據(jù)；符合客觀規(guī)律；設(shè)計科學(xué)。 6、可行性原則：主要技術(shù)指標(biāo)實(shí)現(xiàn)的可能性。 7、效能性原則：社會效益、經(jīng)濟(jì)效益、應(yīng)用價值等。,三、科技人員如何選題 1、課題的概念：為探索醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的某個具體的理 論、方法或技術(shù)問題

57、，根據(jù)假說機(jī)時設(shè)計的旨在說明 三要素（受試對象、施加因素、效應(yīng)結(jié)果）及其相互 關(guān)系并在一定時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)設(shè)計目標(biāo)的最基本的單元。 課題最基本的特征是的探索，其指向是具體的理論、方法或技術(shù)問題； 課題要根據(jù)假說、經(jīng)過設(shè)計； 課題的核心是要說明三要素及其相互關(guān)系； 課題是有時空觀念的，即有邊界、有期限的。,,,,,2、選題的基本程序： （1）提出問題：

58、 A、問題通常產(chǎn)生于觀察與理論之間的矛盾； B、問題產(chǎn)生于懷疑精神與科學(xué)的創(chuàng)造性思維的結(jié)論； C、根據(jù)生產(chǎn)和實(shí)際需要提出問題。醫(yī)學(xué)課題屬此類。 （2）查閱文獻(xiàn)，提出假說： 建立假說是科研工作的前提和靈魂；假說要以科學(xué)的實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，在此基礎(chǔ)上要敢于大膽設(shè)想。 （3）確定題目：體現(xiàn)三要素；體現(xiàn)假說內(nèi)容；留有余 地；言簡意賅，用詞具體；25個漢字，不用縮寫。 （4）提出科研設(shè)計：專業(yè)設(shè)計；統(tǒng)計

59、學(xué)設(shè)計。,3、選題的基本方法： A、同步選擇法：與科技發(fā)展前沿、主流同步； B、階段分析選擇法：根據(jù)學(xué)科發(fā)展不同階段； C、交叉點(diǎn)選擇法：不同學(xué)科的交叉點(diǎn)； D、移植選擇法：將某學(xué)科方法移植到另一學(xué)科； E、機(jī)遇線索捕捉法：偶然發(fā)現(xiàn)、思想火花等； F、經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)移選擇法：用解決某問題的經(jīng)驗(yàn)去解決 另一問題； G、適應(yīng)需要選擇法： H、缺點(diǎn)列舉選擇法：,謝 謝