第五章細(xì)菌的遺傳與變異

1、,遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因的轉(zhuǎn)移與重組菌種選育和保藏,Gene（基因）,基因（gene）— DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。基因組（genome）— 一個(gè)物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱。 基因型（genotype）— 生物的全部遺傳因子。 表型（phenotype）— 與基因型相對(duì)，是生物在特定條件下表現(xiàn)出來的全部性狀。表型是由基因型所

2、決定，但也和環(huán)境有關(guān)。,突變（mutation）— DNA或RNA中核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定可遺傳的變化，導(dǎo)致生物的部分性狀發(fā)生可遺傳的變異。 基因突變：DNA鏈上一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基發(fā)生置換、缺失或插入引起的突變，涉及范圍小，又稱點(diǎn)突變（Point Mutations） 。 染色體畸變：大段染色體的缺失、重復(fù)、異位和倒位，即較大范圍內(nèi)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。,The three major single chromosome mutat

3、ions 1.deletion； 2.duplication；3.inversion,基因突變 (gene mutation),表型飾變 (phenotypic modification),—不同環(huán)境下相同基因型的微生物表現(xiàn)出不同的表型，是暫時(shí)的，非遺傳性的改變。 eg.0.1%石炭酸抑制變形桿菌的鞭毛生長,普通瓊脂培養(yǎng)基,0.1%石炭酸培養(yǎng)基,粘質(zhì)沙雷菌,基因突變的基本特點(diǎn),自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性稀少性 ( 突變率10-6-10-9

4、 )可誘發(fā)性獨(dú)立性穩(wěn)定可遺傳性可逆性 野生型菌株、突變株 (Wild type 、 mutant) 回復(fù)突變,基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性,判斷下面表述是否正確：抗藥性突變是由于接觸了藥物所引起的?？故删w的突變是由于接觸了噬菌體所引起的。抗紫外線的突變是由于接觸了紫外線所引起的。,突變的性狀與引起突變的原因間沒有直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系!,如何證明基因突變的非對(duì)應(yīng)性？,三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn),

5、變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn),變量實(shí)驗(yàn)Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe的涂布實(shí)驗(yàn)（1949）,影印實(shí)驗(yàn)Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,J. Lederberg is awar

6、ded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,Joshua Lederberg,,以上實(shí)驗(yàn)證明 基因突變的非對(duì)應(yīng)性即：突變的性狀與引起突變的原因間沒有直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系！,,1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：微生物經(jīng)突變后失去對(duì)某種生長因子（維生素、氨基酸、核苷酸等）的合成能力，必須依靠外界供應(yīng)才能生長，這種突變株稱為營養(yǎng)缺陷型。表示方法：基因型：前三

7、個(gè)英文，小寫，斜體如：hisC 表示組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C表示同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisChisC-和hisC+ ，分別表示組氨酸缺陷型和野生型。,在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長,在完全培養(yǎng)基上可以生長，為負(fù)選擇標(biāo)記。 微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段。,突變株的類型及實(shí)際應(yīng)用,Ames Test,美國加利福尼亞大學(xué)的Bruce Ames教授于1

8、966年發(fā)明，用于檢測(cè)某種新藥是否具有誘變和致癌作用。,“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則： 人和微生物在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良后果。,誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正比。超過95%的致癌物質(zhì)對(duì)微生物有誘變作用，90%以上的非致癌物質(zhì)對(duì)微生物沒有誘變作用。,誘變劑與致癌物質(zhì),試驗(yàn)菌株特征：具有不同的、經(jīng)遺傳學(xué)確證

9、的組氨酸營養(yǎng)缺陷；細(xì)胞壁組成（脂多糖）缺陷，對(duì)有機(jī)化合物有高度滲透性；DNA切除修復(fù)功能缺陷回復(fù)突變(reverse mutation/back mutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變。,Ames Test,具體操作：檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率,Ames test,證明Ames試驗(yàn)重要性

10、的應(yīng)用實(shí)例：,國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！?，由于其藥效顯著，在20世紀(jì)60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)停”，后來采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免。,3）抗性突變型（resistant mutant）,分為抗藥性、抗噬菌

11、體和抗紫外線等?？顾幮裕杭?xì)菌對(duì)某種抗菌藥物敏感性降低或產(chǎn)生耐藥性，是遺傳學(xué)研究中重要的選擇性標(biāo)記。正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得）表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫、斜體、英文字母加上“r” strr 和 strs 分別表示對(duì)鏈霉素的抗性和敏感性,2） 高產(chǎn)突變株正變株：產(chǎn)量提高 負(fù)變株：產(chǎn)量降低,4）條件致死突變型（conditional lethal mutant）,在某一條件下具有致死效

12、應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。負(fù)選擇標(biāo)記如溫度敏感突變型（Ts，temperature sensitive mutant ）, 在高溫下(如42℃)是致死的，可以在低溫(如25-30℃)下得到這種突變。 常被用來分離生長繁殖必需的突變基因。,5）形態(tài)、結(jié)構(gòu)、毒力的變異,膽汁、甘油、馬鈴薯培養(yǎng)基牛型結(jié)核桿菌 卡介苗  &#

13、160;                13年 ( 230代 ) (BCG) Calmette-Guerin 疫苗 生物武器,,自發(fā)突變（spotaneous mutation） 沒有人

14、工參與下生物體自然發(fā)生的突變，一般頻率較低，通常為10-6-10-9 。機(jī)制：環(huán)境因素的誘變堿基結(jié)構(gòu)的變化：如T和G酮式和烯醇式構(gòu)型的互變, C與A氨基式和亞氨式構(gòu)型的互變,導(dǎo)致AT→GC或GC→AT的置換。環(huán)出效應(yīng)轉(zhuǎn)座效應(yīng),基因突變的分子機(jī)制,誘變 (mutagenesis) 人為用理化因素誘導(dǎo)生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，突變以較高的頻率產(chǎn)生。 誘變劑（mutagen）：能提高突變率的任何理化因子。誘變機(jī)制：堿基

15、置換、移碼突變、插入或缺失,基因突變的分子機(jī)制,,1、堿基置換（Base-pair substitution ）DNA復(fù)制中，一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基取代，造成配對(duì)錯(cuò)誤。包括轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）,5-溴尿嘧啶(5-BU)引起的突變,5-BU是胸腺嘧啶的代謝類似物,亞硝酸(HNO2) 引起的突變,腺嘌呤脫氨成次黃嘌呤,2、移碼突變（Frame Shift Mutation）：DNA分子中一對(duì)或少

16、數(shù)幾對(duì)核苷酸的增加或缺失而造成的基因突變。,紫外線的誘變機(jī)制,UV導(dǎo)致DNA分子鏈上氫鍵的斷裂、磷酸-戊糖骨架斷裂、嘧啶的水合作用、胸腺嘧啶二聚體的形成(包括鏈間或鏈內(nèi))。,DNA損傷的修復(fù),光復(fù)活作用（photoreactivation）　 將經(jīng)紫外線照射后的細(xì)胞立即暴露在可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率，稱光復(fù)活作用。 光復(fù)活酶在黑暗中專一地識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合，形成酶-DNA復(fù)合物，該酶可利用可見光能將二聚體解體，使

17、DNA損傷得到修復(fù)。,遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因的轉(zhuǎn)移與重組菌種選育和保藏,基因的轉(zhuǎn)移和重組,基因重組（genetic recombination）： 兩個(gè)不同個(gè)體內(nèi)的遺傳基因通過重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方法。重組子（recombinant）：經(jīng)基因重組后形成的有新遺傳特性的細(xì)胞。,基因重組的主要方式轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)導(dǎo)原生質(zhì)體融合,轉(zhuǎn)化（transformation）- 受體菌接受供體菌裸

18、露的DNA片段，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的過程。轉(zhuǎn)化子（ transformant ）：轉(zhuǎn)化后能穩(wěn)定表達(dá)供體菌部分遺傳性狀的重組子。,? 1928年Griffith首先進(jìn)行了細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。? 1944年Avery利用轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)了DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。,轉(zhuǎn)化的條件（1）外源DNA片段 雙鏈DNA，大?。∕W為106~108） 同源性（一般30%以上即認(rèn)為同源性較高） DNA純度（2）受體菌的生理

19、狀態(tài) 感受態(tài)(competence)： 受體菌能夠從周圍環(huán)境中吸收外源 DNA 分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞: 具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞與菌的特異性，生長期及培養(yǎng)條件有關(guān)； Ca2+、Mg2+；,自然轉(zhuǎn)化；人工誘導(dǎo)（CaCl2）；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(PEG)；電轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化過程,主要通過 3 個(gè)步驟完成。  1、感受態(tài)細(xì)胞 ：CaCl2 處理 2、DNA 的結(jié)合和攝取 供體雙鏈 DNA 與受體細(xì)

20、胞壁上的接受位點(diǎn)相結(jié)合，隨后其中一條鏈被內(nèi)切核酸酶降解，降解產(chǎn)生的能量把另一條鏈推進(jìn)受體細(xì)胞。 3、 轉(zhuǎn)化因子與染色體重組 當(dāng)單鏈DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，與受體染色體 DNA 同源片段發(fā)生交換重組，形成供體 DNA-- 受體 DNA 復(fù)合物，再通過錯(cuò)配修復(fù)或DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂形成轉(zhuǎn)化子。,基因重組的主要方式轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)導(dǎo)原生質(zhì)體融合,接合(conjugation),供體菌和受體菌通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸，遺傳物質(zhì)自

21、供體菌轉(zhuǎn)移入受體菌，使后者獲得前者的部分遺傳性狀，這種基因轉(zhuǎn)移方式稱為接合。,F質(zhì)粒結(jié)構(gòu)復(fù)制和不相容區(qū)轉(zhuǎn)移區(qū)插入?yún)^(qū)（重組區(qū)）,F plasmid,,F因子的存在方式及E.coli的四種接合型菌株,×,F+,F+,F+,+,,,×,F+,F+,F+,+,,×,Hfr,F-,Hfr,+,,,×,F’,F’,F’,+,,,Hfr菌株與F-菌株接合時(shí)，能帶動(dòng)細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移入F-菌株，并以很高頻率與

22、受體菌染色體重組，由此而得名為高頻重組菌株（high frequency of recombination strain ，Hfr strain）。Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。通過F′因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變遺傳性狀的現(xiàn)象稱為F’因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction）或性導(dǎo)（sexduction）。,基因重組的主要方式轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)導(dǎo)原生質(zhì)體融合,以噬菌

23、體為媒介，將供體菌的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞，通過交換與整合，使受體菌獲得供體菌的部分遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移方式。,轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（Transducing phage）.通過轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得新遺傳性狀的受體菌叫轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。轉(zhuǎn)導(dǎo)分為：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalized transduction)

24、 完全缺陷噬菌體將供體菌任意DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。媒介—烈性或溫和噬菌體。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（complete transduction）－外源DNA通過與受體細(xì)胞染色體的基因重組而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子,,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduction）,,轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。,,特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。,,舉例：E.co

25、li 的λ噬菌體，插入位點(diǎn)兩側(cè)為gal和bio基因，不正常切割時(shí)可包裝入噬菌體外殼，形成缺陷噬菌體，再感染時(shí)形成局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。,局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(restricted /specialized transduction)——通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌并表達(dá)。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別,溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？,基因重組的主要方式轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)導(dǎo)原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合(protoplast fusio

26、n)—兩種細(xì)胞經(jīng)溶菌酶或青霉素等處理，失去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后相互融合的過程。,,遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因的轉(zhuǎn)移與重組菌種選育和保藏,菌種保藏,影響因素：低溫、干燥、隔絕空氣 傳代培養(yǎng)保藏法斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（保藏厭氧細(xì)菌）液體石蠟保藏法沙土保藏法液氮保藏法 寄主保藏法冷凍干燥保藏法,,斜面,液氮罐,超低溫冰箱,凍干管,菌懸液/甘油管,液體石蠟,Review,遺傳、變異、基