石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與分布特性研究.pdf

1、本論文以16S rRNA為分子標(biāo)記，分別以克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序法探討克拉瑪依油田石油污染土壤中細(xì)菌群落多樣性和系統(tǒng)發(fā)育，并分析環(huán)境因子與群落分布的關(guān)系，為生物處理石油污染物提供理論基礎(chǔ)。
　　在克拉瑪依油田分別采集離地面5、20、50 cm的石油污染土壤樣品，測(cè)定環(huán)境參數(shù)；提取石油污染土壤細(xì)菌群落基因組DNA，分別構(gòu)建三個(gè)土層細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)，利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Restriction Fragment L

2、ength Polymorphisms RFLP)技術(shù)初步分群，確定各文庫(kù)中的代表菌株并測(cè)定16S rRNA基因序列；利用軟件Biodap計(jì)算各群落多樣性和豐富度指數(shù)，以Neighbor-joining法構(gòu)建三個(gè)土層細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；運(yùn)用程序CANOCO結(jié)合不同樣品理化性質(zhì)的差異進(jìn)行典型對(duì)應(yīng)分析(CCA)，并探討了土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。高通量測(cè)序法用稀釋后的土壤總DNA為模板，利用16S V4區(qū)515F和806R做引物，進(jìn)行

3、PCR擴(kuò)增，構(gòu)建文庫(kù)，利用Hiseq2500進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，研究石油污染土壤細(xì)菌多樣性。
　　環(huán)境參數(shù)結(jié)果表明20 cm土層總磷(TP)、總氮(TN)值最低，50 cm值最高；5 cm土壤里有機(jī)碳(TOC)的值最高，50 cm的值最小。基于16S rRNA序列的生物多樣性和細(xì)菌豐富度值表明20 cm土層生物多樣性和豐富度值較高，而50 cm土層各項(xiàng)指數(shù)均較低。各土層供試序列RFLP聚類分析表明，克拉瑪依油田石油污染土層微生物種群的豐

4、度值較高。Neighbor-joining建立的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，石油污染土壤被分為5大類，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉?fàn)罹T(Planctomycetes)。高通量測(cè)序法結(jié)果表明，三層土壤樣品中所含的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群大致相同，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobact

5、eria)、厚壁菌門(Firmicutes)。3個(gè)樣品的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均較大，其中20 cm土樣的豐度最高多樣性豐富，5 cm土樣其次,50 cm土樣相對(duì)較低。3個(gè)土壤樣品文庫(kù)覆蓋率都達(dá)到99％以上，說(shuō)明本研究中各樣品文庫(kù)包含了大多數(shù)細(xì)菌類群，能夠充分反映土樣中細(xì)菌類群分布特征及豐富度。在門分類水平，三層土壤主要菌門是變形菌門(Proteobacteria)，屬分類水平三層土壤共有的最主要菌屬是海桿菌屬(Marinob

6、acter)。CCA分析石油污染土壤環(huán)境因子與細(xì)菌類群之間的關(guān)系，分析可得TOC、TP和TN含量是改變細(xì)菌類群分布特征的重要因素。
　　克隆文庫(kù)法與高通量測(cè)序法在反映樣本中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群的結(jié)果基本相同，而在反應(yīng)石油污染土壤微生物群落規(guī)模上差異較大。就Shannon指數(shù)和Simpon指數(shù)反映的結(jié)果顯示，高通量測(cè)序優(yōu)于克隆文庫(kù)，即高通量測(cè)序比克隆文庫(kù)更能較客觀反映石油污染土層里細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。
　　兩種方法測(cè)試結(jié)果表明石油