腺病毒載體操作介紹及其說明介紹說明中文版解析

1、#腺病毒載體操作手冊(cè)中文版腺病毒載體操作手冊(cè)中文版AdEasyTM操作手冊(cè)目錄第一章簡(jiǎn)介1第二章應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn)2第三章AdEasyTM技術(shù)33.1技術(shù)概況33.2AdEasyTM系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程3第四章主要流程44.1將基因克隆入AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體44.1.1克隆的一般原則44.1.2構(gòu)建重組AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體54.2細(xì)菌內(nèi)AdEasyTM重組子的產(chǎn)生54.2.1共轉(zhuǎn)化的一般原則54.2.2共轉(zhuǎn)化方法54.2

2、.3預(yù)期結(jié)果54.3AdEasyTM重組質(zhì)粒的篩選和擴(kuò)增64.4AdEasyTM重組子轉(zhuǎn)染QBI293A細(xì)胞64.4.1細(xì)胞鋪板64.4.2磷酸鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)7第五章常用技術(shù)85.1QBI293A細(xì)胞培養(yǎng)85.1.1QBI293A細(xì)胞的初始培養(yǎng)85.1.2QBI293A細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖85.1.3QBI293A細(xì)胞的凍存85.2QBI293A細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和病毒空斑的產(chǎn)生95.2.1感染QBI293A細(xì)胞95.2.2病毒空斑形成95.2.3

3、瓊脂糖覆蓋被感染細(xì)胞95.3MOI測(cè)定105.4腺病毒感染力測(cè)定105.4.1XGal染色115.5重組腺病毒的篩選和純化115.5.1挑選最佳重組腺病毒：表達(dá)和基因輸送115.5.2病毒空斑挑選和小量擴(kuò)增125.5.3Western雜交135.5.4Southern雜交和點(diǎn)雜交135.5.5病毒裂解產(chǎn)物PCR145.5.6免疫測(cè)定145.5.7功能測(cè)定145.6病毒顆粒在QBI293A細(xì)胞中的大量擴(kuò)增155.7兩次氯化銫密度梯度離心純

4、化重組腺病毒165.7.1不連續(xù)密度梯度離心175.7.2連續(xù)密度梯度離心175.7.3病毒溶液去鹽和濃集175.8病毒滴度測(cè)定185.8.1O.D.260nm(VPml)195.8.2空斑測(cè)定法205.8.350%組織培養(yǎng)感染劑量法20第六章疑難解答226.1QBI293A細(xì)胞培養(yǎng)226.2感染力測(cè)定226.3轉(zhuǎn)移載體克隆236.4在BJ5183細(xì)胞中共轉(zhuǎn)化和重組246.5轉(zhuǎn)染QBI293A細(xì)胞256.6篩選和測(cè)定256.7在QBI2

5、93A細(xì)胞中表達(dá)266.8重組腺病毒的擴(kuò)增266.9純化266.10病毒滴度測(cè)定27縮寫英文全稱中文全稱AdAdenovirus腺病毒Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVect腺病毒載體AmpAmpicillin氨芐青霉素βGalβGalactosidaseβ半乳糖苷酶bpBasePair堿基對(duì)BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDN

6、A互補(bǔ)DNAcccDNAClosedCircularCoiledDNA閉環(huán)螺旋DNACPECytopathicEffect細(xì)胞病理效應(yīng)#腺病毒的研究人員才會(huì)采用腺病毒系統(tǒng)。昆騰生物科技公司是第一個(gè)提供完備而且能廣泛應(yīng)用的重組腺病毒試劑盒AdenoQuestTM系統(tǒng)及其相關(guān)產(chǎn)品和客戶服務(wù)的公司，這個(gè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)是在293細(xì)胞中產(chǎn)生重組腺病毒?，F(xiàn)在介紹的AdEasyTM系統(tǒng)以細(xì)菌內(nèi)重組取代哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Heetal，1998），使獲得重組腺病

7、毒對(duì)任何有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的分子生物實(shí)驗(yàn)室都更方便。重組腺病毒事實(shí)上可在任何細(xì)胞或組織中用來研究表達(dá)重組蛋白。AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體可允許插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它區(qū)的缺失以提高腺病毒在基因治療中的應(yīng)用。這本手冊(cè)提供了重組腺病毒技術(shù)中所有必須遵循的原則，并詳細(xì)描述了產(chǎn)生一個(gè)重組腺病毒的所有實(shí)驗(yàn)步驟，包括重組腺病毒在QBI293A細(xì)胞中擴(kuò)增并純化到1012VP的操作步驟。AdEasyTM載體系統(tǒng)包含了生產(chǎn)5型重組腺病毒

8、所需的全部試劑，所有成分購買后即可使用。第二章應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1.宿主范圍廣對(duì)人致病性低這套腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達(dá)。腺病毒可感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可用來表達(dá)重組蛋白。2.在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是

9、研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對(duì)比。3.能有效進(jìn)行增殖，滴度高這套腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010到1011VPml，濃縮后可達(dá)1013VPml，這一特點(diǎn)使它非常適用于基因治療。4.無需輔助病毒，可容納7.5kb外源DNA為提供克隆空間，此腺病毒缺失了E1和E3早期區(qū)。此外，此腺病毒可包裝比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。這些特點(diǎn)允許插入腺病毒的基因或多基因表達(dá)盒可達(dá)7.5kb。

10、5.與人類基因同源該腺病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用了人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，因此為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能。6.不整合到染色體中，無插入致突變性逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會(huì)干擾其它的宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)

11、物的一個(gè)較好的系統(tǒng)。7.能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293細(xì)胞可在1~20L的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白。8.能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因這是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織中用來設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng)。最簡(jiǎn)單的方法是將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來分別表達(dá)一個(gè)蛋白。測(cè)定不同重組病毒的MOI比值可正確估計(jì)各重組蛋白的相對(duì)共表達(dá)情況。第三