2012版分子細(xì)胞生物學(xué)的研究方法-期末

1、....一陳瑞川（1）GenetransfertogetstablecelllineA.Transient（短暫的）transfection1.Liposome（脂質(zhì)體）mediatedgenetransfer:Lipofectamine（脂質(zhì)體）transfection2.Ca2.Ca2.Ca33(PO(PO(PO44))22––mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfert

2、ransfer3.PEI3.PEI3.PEI（（聚乙二胺））mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfertransfer4.4.4.ElectropationElectropationElectropation（（電穿孔））B.Stabletransfection1.Adenovirusinfection（腺病毒感染）2.Retrovirusinfection（反轉(zhuǎn)錄病毒載體法

3、）3.Lentivirusinfection（慢病毒載體轉(zhuǎn)染法）4.Cotransfection.（2）HowtogetStablecellline1.Infectioncotransfection2.Antibioticsion3.Coloniesgrowth4.Expressiondetection5.Celllinestage（（33））HomologyHomologyHomologysearchsearchsearchofofo

4、fexistingexistingexistingcDNAcDNAcDNAdatadatadatabasesbasesbasesGenBankGenBankGenBankBlastBlastBlastNCBINCBINCBIBlastBlastBlastHomeHomeHomePage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.

5、nih.govBLASTGoGoGotototoProteinProteinProteinBlastBlastBlastPagePagePagePastePastePasteyouryouryourproteinproteinproteinsequencesequencesequenceenterenterenteraccessionaccessionaccessionnumbernumbernumberofofofyouryouryo

6、urproteinproteinproteinintointointothethetheboxboxboxUsuallyUsuallyUsuallyProteinproteinProteinproteinProteinproteinBlast.Blast.Blast.AK056946AK056946AK056946HomoHomoHomosapienssapienssapienscDNAcDNAcDNAFLJ32384FLJ32384F

7、LJ32384fisfisfiscloneclonecloneSKMUS1000104SKMUS1000104SKMUS1000104weaklyweaklyweaklysimilarsimilarsimilartototoHomoHomoHomosapienssapienssapiensmRNAmRNAmRNAfffHEXIM1HEXIM1HEXIM1proteincompleteproteincompleteproteincompl

8、etecds.cds.cds.二二二二俞春東俞春東俞春東俞春東（（11））什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？答：答：答：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：是經(jīng)連續(xù)是經(jīng)連續(xù)是經(jīng)連續(xù)202020代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）

9、的全同胞兄妹交配（或親代與子代交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第202020代或以后代或以后代或以后代數(shù)的一對共同祖先。代數(shù)的一對共同祖先。代數(shù)的一對共同祖先。特性：特性：特性：特性：1.1.1.基因位點(diǎn)的純合性（基因位點(diǎn)的純合性（基因位點(diǎn)的純合性（HomozygosityHomozygosityHomozyg

10、osity））近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)999999％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖....毛色毛色毛色agoutiagoutiagouti棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）應(yīng)用：1980年代，具穩(wěn)定性的小鼠胚胎干細(xì)胞株皆源自129Sv純系小鼠。1990年代，基因定位(genetargeting)試驗(yàn)結(jié)

11、果證實(shí)其為極成功的動(dòng)物模型。4.4.4.FVBFVBFVB系系毛色白化毛色白化毛色白化起源起源起源源自遠(yuǎn)交系源自遠(yuǎn)交系源自遠(yuǎn)交系SwissSwissSwiss鼠。鼠。鼠。193519351935年，在年，在年，在NIHNIHNIH飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，196619661966年起開始選育，在年起開始選育，在年起開始選育，在接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系HSFSNHSFSNHSFSN對組胺對組胺

12、對組胺(Histamine)(Histamine)(Histamine)敏感。敏感。敏感。707070年代年代年代初，在初，在初，在HSFSNHSFSNHSFSN系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶Fv1Fv1Fv1bb基因?qū)驅(qū)驅(qū)BstrainstrainstrainFriendFriendFriend白白血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成Fv1Fv1Fv1bb同型合子近

13、交系，稱同型合子近交系，稱同型合子近交系，稱FVBFVBFVB。。NIHNIHNIH、、JacksonJacksonJackson等保等保等保存。存。存。應(yīng)用：應(yīng)用：應(yīng)用：FVBFVBFVB通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射DNADN

14、ADNA。。3.3.3.我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系1946年，我國從印度Haggkine研究所引入小鼠，這是當(dāng)今廣泛應(yīng)用的昆明種小鼠昆明種小鼠的原種。應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)（（11）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物

15、就可得到非常規(guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可得到非常規(guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（（22）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。（（33）明顯的生物學(xué)特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學(xué)

16、特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學(xué)特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。（（44）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影響，還可

17、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。響，還可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。響，還可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。190919091909年，年，年，C.C.C.C.C.C.LittleLittleLittle首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了DBADBADBA近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展史上發(fā)展史上發(fā)展史上第一個(gè)近交系動(dòng)物。第一個(gè)近交系動(dòng)物。第一個(gè)近交系動(dòng)物

18、。第一個(gè)近交系動(dòng)物。（（22））設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。基因敲除（基因敲除（基因敲除（基因敲除（knockoutknockoutknockout））是是202020世紀(jì)世紀(jì)世紀(jì)808080年代后半期應(yīng)用年代后半期應(yīng)用年代后半期應(yīng)用DNADNADNA同源重組原理發(fā)展起來同源重組原理

19、發(fā)展起來同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)，指對一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)的一門新技術(shù)，指對一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)的一門新技術(shù)，指對一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測相應(yīng)基因

20、的功能。測相應(yīng)基因的功能。測相應(yīng)基因的功能。目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為129SV129SV129SV）的）的）的ESESES細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞主要是因?yàn)橹饕且驗(yàn)橹饕且驗(yàn)镋SESES細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的多潛能細(xì)胞建立的，在體細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的多潛能細(xì)胞建立的，在體細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中

21、的多潛能細(xì)胞建立的，在體外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（LIFLIFLIF）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外ESESES細(xì)胞有細(xì)胞有細(xì)胞有利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。步驟：步驟：1.構(gòu)建打靶載體（含有一段與欲敲除的基因具有高度同源性外