刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制的初步研究.pdf

1、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指植物體細(xì)胞在特定條件下未經(jīng)性細(xì)胞融合而發(fā)育成胚狀體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。它在快速繁殖、人工種子、種質(zhì)保存、基因工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。體細(xì)胞胚發(fā)生是細(xì)胞全能性的具體體現(xiàn)，重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的過(guò)程，為此深入地研究體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育的機(jī)制對(duì)于揭示細(xì)胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、分子生物學(xué)等機(jī)制有重要意義。
　　本論文以刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生為研究?jī)?nèi)容，對(duì)刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生形態(tài)觀察、生理生化進(jìn)行了研究;利用

2、質(zhì)壁分離處理刺五加合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，對(duì)胼胝質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化與體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行研究;同時(shí)，以刺五加體細(xì)胞胚早期發(fā)育三個(gè)時(shí)期為試材，采用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)刺五加體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上，對(duì)三個(gè)時(shí)期進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)譜分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析及分類，并篩選與刺五加早期體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)基因，探討刺五加的體細(xì)胞胚早期發(fā)生機(jī)制，為進(jìn)一步研究刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生提供分子資源。主要結(jié)果如下:
　　1.刺五加體

3、細(xì)胞胚發(fā)生經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚，最后發(fā)育成體胚苗，測(cè)定了刺五加胚性愈傷組織、球形胚、魚雷胚、子葉胚、體胚苗中的可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量，同時(shí)，對(duì)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性進(jìn)行測(cè)定。刺五加胚性愈傷組織中可溶性糖含量最高，隨著體細(xì)胞胚的發(fā)育，含量逐漸降低;淀粉在整個(gè)發(fā)育時(shí)期有2個(gè)高峰，球形胚和子葉胚時(shí)期;隨著體細(xì)胞胚的發(fā)育，可溶性蛋白含量呈上升趨勢(shì)，由胚性愈傷組織到球形胚時(shí)期上升速度較快;從胚性愈傷組織到成熟體胚苗發(fā)

4、育過(guò)程中，SOD活性逐漸升高;胚性愈傷組織中POD活性最高，其活性表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。這些物質(zhì)的變化可能與體細(xì)胞胚的分化、發(fā)育相關(guān)。
　　2.質(zhì)壁分離處理產(chǎn)生的胼胝質(zhì)與體細(xì)胞胚發(fā)生呈正相關(guān)。
　?、儋|(zhì)壁分離處理刺五加合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的最佳試劑是1.0M甘露醇，其最佳處理時(shí)間是12小時(shí)。
　　②質(zhì)壁分離處理過(guò)程中和體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，胼胝質(zhì)含量都有很大的變化。質(zhì)壁分離處理12小時(shí)的外植體材料中，胼胝質(zhì)含量較高，體

5、細(xì)胞胚的發(fā)生數(shù)目最多。處理外植體材料中的胼胝質(zhì)在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中先下降，然后隨著體細(xì)胞胚發(fā)生而升高。
　?、劾眉す夤簿劢癸@微鏡觀察胼胝質(zhì)沉積情況，質(zhì)壁分離處理刺五加合子胚時(shí)，胼胝質(zhì)主要沉積在細(xì)胞膜周圍。質(zhì)壁分離處理誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，胼胝質(zhì)在不同組織沉積有較大的差別，在表皮和維管組織中有大量的沉積，而在其它組織中沉積很少。
　?、芘咝杂鷤M織中可觀察到大量胼胝質(zhì)的沉積，而非胚性愈傷組織中觀察不到胼胝質(zhì)的沉積。

6、　?、蓦蓦召|(zhì)抑制劑(2-DDG)的加入，降低了體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)，體細(xì)胞胚發(fā)生率僅為11.5％。
　　3.刺五加早期體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總共進(jìn)行58，327，688次讀數(shù)，最后共獲得75，803個(gè)Unigene。這些Unigene被COG、GO、KEGG進(jìn)行注釋。數(shù)字基因表達(dá)譜表明刺五加不同發(fā)育階段(EC，YEC，GE)基因表達(dá)差異情況。每個(gè)樣本獲得5.6M以上的tags，獲得了不同發(fā)育階段差異表達(dá)的基因，