間斑寇蛛卵粒毒素的分離純化與生物學特性分析.pdf

1、間斑寇蛛(L.tredecimguttatus)俗稱黑寡婦蜘蛛或黑毒蜘蛛，是一種中型蜘蛛。在分類學上隸屬于節(jié)肢動物門，蛛形綱，蜘蛛目，球蛛科，寇蛛屬。間斑寇蛛是目前世界上已知毒性最強的蜘蛛之一，與其他有毒動物不同的是，不僅在其毒腺毒液中存在毒性成分，而且在身體的其他組織(如腿、腹部組織等)以及卵粒中也存在毒性成分。二十世紀七十年代，美國學者采用化學與生物藥理學等方法對間斑寇幼蛛和成蛛的蛛卵粒和腹部等組織中的毒性成分進行了初步的分離純化研

2、究，但到目前為止還沒有對間斑寇蛛卵粒毒素成分進行系統(tǒng)分離純化和結(jié)構(gòu)與功能分析的相關(guān)報道。在本文中，我們采用溶液抽提方式獲得卵粒提取物，對提取物的生物學活性等特征做了較為詳細的研究；采用凝膠過濾層析和離子交換層析等方法對卵粒提取物中的蛋白質(zhì)與多肽類成分進行了分離純化研究，并對分離純化得到的活性成分進行了結(jié)構(gòu)與功能研究。
　　 蛋白質(zhì)定量測定表明，間斑寇蛛卵粒提取物干物質(zhì)蛋白質(zhì)含量為34.23％。卵粒提取物對小鼠具有較強的毒性，腹腔

3、注射小鼠的LD50值為3.23 mg/kg。小鼠經(jīng)腹腔注射卵粒提取物后，出現(xiàn)昏睡，體溫下降，身體蜷縮，呼吸急促，活動力減弱，身體抽搐，喘式呼吸，大小便失禁，尾巴發(fā)紫，毛發(fā)皺褶等一系列癥狀。酶活性分析發(fā)現(xiàn)卵粒提取物具有多種酶活性，包括透明質(zhì)酸酶、乙酰膽堿酯酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、蛋白水解酶等。電生理實驗發(fā)現(xiàn)，250μg/mL卵粒提取物可以在12.0±1.5 min內(nèi)完全阻斷小鼠膈神經(jīng)一膈肌標本的神經(jīng)肌肉的接頭信號傳遞。用臺式液洗滌后再

4、刺激膈神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)這種阻斷效應(yīng)可以部分消除。
　　 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對卵粒提取物進行分離后圖像分析發(fā)現(xiàn)卵粒提取物中分子量大于10 kDa的蛋白質(zhì)含量豐富，而分子量低于10 kDa的低分子量蛋白質(zhì)和多肽含量較少。從圖像上可以看到8個染色較深的蛋白質(zhì)條帶以及10個以上染色較淡的蛋白質(zhì)條帶。在隨后的凝膠過濾層析中，卵粒提取物通過Sephacryl S-100 HighResolution Hiprep26/60柱分離得到7個

5、組分(命名為P1～P7)，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)分子量不同的組分得到了較好的分離。其中P1～P4為分子量大于10 kDa的大分子蛋白質(zhì)成分，P5～P7為分子量小于10 kDa的低分子量成分。通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)，大分子成分都能阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌的神經(jīng)肌肉傳遞。當加入1.15mg/mL的P1成分時，完全阻斷時間為17.0 min，用臺式液漂洗不能消除其阻斷效應(yīng)；分別加入1.50 mg/mL的P2成分或1.33 mg/mL的

6、P3成分后，都能在30 min內(nèi)完全阻斷神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，臺式液漂洗都能恢復(fù)電刺激引起的膈肌收縮。而P4成分毒性較弱，添加1.10 mg/mL的P4成分后，其阻斷時間超過80 min。
　　 隨后，我們通過DEAE離子交換對P3中的成分進行了進一步的分離純化，得到5個主要分離峰(命名P3-1至P3-5)，其中P3-1，P3-2，P3-4(約20 kDa)在SDS-PAGE電泳中顯示單一蛋白質(zhì)條帶，提示蛋白質(zhì)成分已得到有效的分離純化。

7、利用電生理、N末端測序和蛋白質(zhì)組學方法等多種策略對純化的蛋白質(zhì)進行了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能分析。電生理活性分析發(fā)現(xiàn)，P3-1成分不能阻斷膈神經(jīng)-膈肌接頭傳導(dǎo)。P3-4成分濃度為1.26×107-4g/mL(約6.3μ mol/L)時，能在40 min內(nèi)完全阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標本的神經(jīng)肌肉信號的傳遞，用臺氏液洗滌可部分消除這種阻斷效應(yīng)。此外，膜片鉗實驗結(jié)果表明，P3-4能激活DRG細胞膜上的TTX-S型Na+離子通道。采用Edman降解測序獲