一氧化碳釋放分子對人牙周膜成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)，作為外源性CO的供源，CORM-3應(yīng)用于炎癥因子誘導(dǎo)的人牙齦成纖維(HGF)細(xì)胞時(shí)能夠抑制其黏附分子的表達(dá)，抑制免疫活性細(xì)胞向牙周組織黏附、浸潤和深部遷移，從而減輕宿主的炎性病理反應(yīng)。前期研究結(jié)果提示我們CORM-3的應(yīng)用可為牙周病的治療提供了一種極具潛力的方法?；谝陨涎芯勘尘?，我們以人牙周膜成纖維細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停訪PS和尼古丁共同刺激來模擬吸煙的牙周炎患者的牙周組織局部微環(huán)境，研

2、究CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞的毒性、增殖和凋亡的影響，以及在炎性環(huán)境中對牙周膜成纖維細(xì)胞炎性因子和破骨細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用，同時(shí)探討HO-1通路是否參與CORM-3對上述因子表達(dá)的調(diào)控。
　　方法：
　　第一部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞的毒性、增殖和炎癥環(huán)境下抑制細(xì)胞凋亡的影響
　　取新鮮拔除的恒牙，用組織塊法分離并培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞，鑒定細(xì)胞來源，取狀態(tài)良好的第4～6代細(xì)胞用于各項(xiàng)試驗(yàn)。采用

3、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)測定不同濃度(0、100、200、400、800μM)CORM-3對HPDLF細(xì)胞的毒性作用;以濃度為0、100、200、400μM的CORM-3刺激細(xì)胞，分別于0，24，48，72，96小時(shí)用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，評價(jià)CORM-3對HPDLF細(xì)胞增值的影響。
　　建立LPS和尼古丁刺激下HPDLF細(xì)胞炎癥模型，采用Annexin V-FITC/PⅠ雙染法、應(yīng)

4、用流式細(xì)胞術(shù)檢測工作濃度的CORM-3是否抑制炎癥環(huán)境下HPDLF細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 CORM-3抑制LPS和尼古丁誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子及破骨細(xì)胞因子表達(dá)的作用及其機(jī)制
　?。ㄒ唬〤ORM-3對LPS和尼古丁誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子和破骨分化因子的影響
　　取新鮮拔除的恒牙，分離并培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞，鑒定細(xì)胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞并以濃度為400μMCO

5、RM-3預(yù)處理細(xì)胞6h，然后以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激24h，用常規(guī)Trizol的方法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法從基因水平檢測炎癥環(huán)境下人牙周膜成纖維細(xì)胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的mRNA表達(dá)以及CORM-3的調(diào)控作用;同樣在CORM-3預(yù)處理6h，然后以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁炎癥誘導(dǎo)24h后，收集HPDLF細(xì)胞提取總蛋白，用蛋白印記實(shí)驗(yàn)方法在蛋白水平檢測炎癥環(huán)境下人牙

6、周膜成纖維細(xì)胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表達(dá)以及CORM-3的調(diào)控作用。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預(yù)處理人牙周膜成纖維細(xì)胞后再以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導(dǎo)致炎，觀察CORM-3對COX-2、PGE2、OPG和RANKL表達(dá)的調(diào)控作用是否還存在，以確定CORM-3的抑炎作用是否由其活性成分CO介導(dǎo)。
　?。ǘ〤ORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響
　　取新鮮拔除的恒牙

7、，分離并培養(yǎng)原代牙周膜成纖維細(xì)胞，鑒定細(xì)胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以濃度為400μM CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后，分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，以實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達(dá)。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預(yù)處理人牙周膜成纖維細(xì)胞6小時(shí)，分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，以實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達(dá)。探討該作用是否由CO

8、RM-3的活性成分CO介導(dǎo)。
　　常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞并以400μM的CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導(dǎo)致炎，24小時(shí)后分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，以實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達(dá)。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預(yù)處理人牙周膜成纖維細(xì)胞6小時(shí)，以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導(dǎo)致炎，24小時(shí)后用上述方法檢測HO-1的表達(dá)，以確定C

9、ORM增強(qiáng)HO-1表達(dá)作用是否由CO介導(dǎo)。
　?。ㄈ〤ORM-3抑制LPS和尼古丁誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子及破骨細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制
　　取新鮮拔除的恒牙，分離并培養(yǎng)原代牙周膜成纖維細(xì)胞，鑒定細(xì)胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。研究CORM-3的抑炎作用是否由機(jī)體細(xì)胞保護(hù)機(jī)制HO-1通路介導(dǎo)。采用LIP03000用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將HO-1基因沉默，以濃度為400μM的CORM-3預(yù)處理人牙周膜成纖維細(xì)胞6小

10、時(shí)，以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細(xì)胞24小時(shí)，分別提取RNA和總蛋白，以實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡法從基因和蛋白產(chǎn)物兩方面檢測HO-1、COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表達(dá)，研究在缺失HO-1通路的介導(dǎo)作用后，CORM-3對炎癥細(xì)胞因子和破骨分化相關(guān)因子的調(diào)控作用是否存在。
　　結(jié)果：
　　第一部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞的毒性、增殖的影響以及抑制炎癥環(huán)境下細(xì)胞凋亡的作用
　　成功分離培

11、養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞，鑒定為中胚層來源。CCK-8檢測結(jié)果濃度為0～400μM的CORM-3刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的數(shù)量以及形態(tài)與正常對照組比較無明顯差異，檢測細(xì)胞活性示與對照組無明顯差異，提示該濃度范圍的CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞無明顯毒性，而800μM的CORM-3對人HPDLF細(xì)胞則有明顯毒性。以0、100、200、400μM的CORM-3刺激HPDLF細(xì)胞，分別于0，24，48，72，96小時(shí)用CCK-

12、8法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果顯示濃度為400μM的CORM-3對HPDLF細(xì)胞有較明顯的促增殖作用。1μg/ml的LPS和5mM尼古丁可促進(jìn)HPDLF細(xì)胞的凋亡，以工作濃度400μM的CORM-3預(yù)處理后，則可抑制炎癥刺激引起的細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞炎性因子及破骨細(xì)胞因子表達(dá)的影響及其作用機(jī)制
　?。ㄒ唬〤ORM-3對LPS和尼古丁誘導(dǎo)下的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用
　　以1μg

13、/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細(xì)胞，炎性細(xì)胞因子COX-2、PGE2、RANKL的表達(dá)量較對照組均顯著升高(P＜0.05)，且骨保護(hù)素OPG的表達(dá)受到明顯抑制。以400μM CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細(xì)胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達(dá)較致炎組均顯著降低(P＜0.05)，而OPG則有明顯提高(P＜0.05)。而完全釋放掉CO的失活的CORM-3則無明顯抑炎作用。證明CO

14、RM-3有抑制LPS和尼古丁誘導(dǎo)的HPDLF細(xì)胞炎癥的作用而且該作用是由CORM-3溶于液體后釋放出的CO介導(dǎo)而不是由其底物。
　　（二）CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響
　　單獨(dú)以濃度為400μM CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后，HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)較對照組比較有顯著提高(P＜0.01);而完全釋放掉CO的失活的CORM-3則無提高HO-1表達(dá)的作用，表明CORM-3有促進(jìn)HPDLF細(xì)胞HO-1高

15、表達(dá)的作用，而且該作用由CORM-3的活性成分CO介導(dǎo)的。
　　以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細(xì)胞，HO-1的表達(dá)較對照組有所升高(P＜0.05);以濃度為400μM的CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后，再以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細(xì)胞，則HO-1的表達(dá)較對照組和致炎組均有顯著升高(P＜0.01);而完全釋放掉CO的失活的CORM-3預(yù)處理細(xì)胞則無提高HO-1表達(dá)的作用。提示1μg/ml LPS+5mM尼古

16、丁的傷害性刺激能提高HO-1的表達(dá)量，而以400μM CORM-3預(yù)刺激后再致炎，則有更顯著的促進(jìn)HO-1高表達(dá)的作用。
　　(三)CORM-3對LPS和尼古丁誘導(dǎo)下的人牙周膜成纖維細(xì)胞的抑炎作用的機(jī)制
　　采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將HO-1基因沉默后，以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細(xì)胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達(dá)較對照組均顯著升高(P＜0.05)，但骨保護(hù)素OPG的表達(dá)無明顯改變;HO-1基因沉默

17、后，以400μM CORM-3預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細(xì)胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達(dá)較對照組顯著升高(P＜0.05)，而且與致炎組比較無明顯變化，雖OPG的表達(dá)無明顯改變，但OPG/RANKL比值顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果顯示在HO-1通路缺失的情況下，CORM-3抑制炎性因子及破骨細(xì)胞因子表達(dá)的作用消失，提示我們CORM-3對LPS和尼古丁誘導(dǎo)下的HPDLF細(xì)胞的抑炎作用

18、是通過HO-1通路介導(dǎo)的。
　　結(jié)論：
　　1.400μM CORM-3對人牙周膜成纖維細(xì)胞無明顯毒性，且有促進(jìn)增殖作用，400μM CORM-3抑制IPS和尼古丁誘導(dǎo)的HPDLF細(xì)胞凋亡。
　　2.400μM CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纖維細(xì)胞炎性因子及破骨細(xì)胞因子表達(dá)。
　　3.400μM CORM-3能顯著增強(qiáng)人牙周膜成纖維細(xì)胞HO-1的表達(dá)。
　　4.CORM-3抑制脂多糖和尼古