碲化鎘(CdTe)量子點(diǎn)對(duì)大鼠海馬體的毒性效應(yīng)及作用機(jī)制研究.pdf

1、新興的納米科技可以極大地改變目前的醫(yī)療現(xiàn)狀，可解決許多醫(yī)學(xué)難題，提供有針對(duì)性的醫(yī)學(xué)診斷和治療。量子點(diǎn)(QDs)作為常用納米材料之一，獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)不僅能保證其熒光強(qiáng)度長(zhǎng)期穩(wěn)定，而且能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)信號(hào)。但是，若要將量子點(diǎn)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，尤其是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，需要充分了解其生物安全性，因此，深入探討量子點(diǎn)的毒性、毒作用機(jī)制及生物安全性評(píng)價(jià)就變得至關(guān)重要。關(guān)于量子點(diǎn)毒性效應(yīng)的研究已有多篇報(bào)道，但是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的毒理學(xué)研究資料卻十分匱乏。

2、鑒于量子點(diǎn)能夠在神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)研究和神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的診斷和治療中起到重要作用，對(duì)其進(jìn)行全面而深入的神經(jīng)毒性研究就顯得十分迫切和必要。
　　本論文主要探討量子點(diǎn)對(duì)大鼠海馬體的神經(jīng)毒性，結(jié)合本課題組長(zhǎng)期以來對(duì)巰基丙酸(MPA)修飾的CdTe量子點(diǎn)已經(jīng)進(jìn)行的肝毒性、腎毒性、呼吸毒性等的毒理學(xué)研究結(jié)果，以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用情況，從基因、分子、細(xì)胞、器官、模式生物、整體動(dòng)物的不同研究水平，探索了CdTe量子點(diǎn)可能導(dǎo)致大鼠海馬體發(fā)生的

3、毒性作用，以及導(dǎo)致這些毒性作用可能的作用機(jī)制。
　　具體的研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)部分:
　　1.CdTe量子點(diǎn)的制備與表征。應(yīng)用電化學(xué)方法合成高質(zhì)量的水溶性MPA修飾的CdTe量子點(diǎn)，通過透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見光分光光度儀(UV-visible light spectrophotometry)、熒光分光光度儀(fluorescence spectrophotometry)、X-射線衍射儀(X-ray diffra

4、ctometer)和Malvern粒徑分析儀(Malvern size analyzer)等對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行表征分析。
　　2.探討CdTe量子點(diǎn)對(duì)模式生物——秀麗隱桿線蟲（以下簡(jiǎn)稱秀麗線蟲或線蟲）的神經(jīng)毒性作用。以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，研究CdTe量子點(diǎn)對(duì)其運(yùn)動(dòng)行為、攝食行為、學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)行為學(xué)的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究CdTe量子點(diǎn)導(dǎo)致這些毒性效應(yīng)可能參與的在基因水平上的神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)和接收途徑。
　　3.研究

5、CdTe量子點(diǎn)對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的毒性作用機(jī)制。以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為體外研究模型，研究CdTe量子點(diǎn)對(duì)神經(jīng)元活性、凋亡發(fā)生、細(xì)胞內(nèi)活性氧生成和胞內(nèi)鈣平衡的影響，以及存在的劑量-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)量子點(diǎn)的特殊理化性質(zhì)，分析了不同粒徑的CdTe量子點(diǎn)導(dǎo)致的細(xì)胞毒性效應(yīng)間的差異。具體從神經(jīng)電生理角度分析了CdTe量子點(diǎn)導(dǎo)致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣水平升高的作用機(jī)制。
　　4.研究CdTe量子點(diǎn)對(duì)大鼠海馬體的神經(jīng)毒性作用。給予Wistar

6、大鼠一定劑量的CdTe量子點(diǎn)，觀察對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并從大鼠的血液生化和組織病理學(xué)結(jié)果找尋量子點(diǎn)造成這些行為學(xué)損傷的原因;再通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序更為深入而全面地研究CdTe量子點(diǎn)對(duì)大鼠海馬體造成的毒性效應(yīng)，以及參與的分子作用機(jī)制和靶點(diǎn);并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)一步深入研究CdTe量子點(diǎn)參與的三條主要分子信號(hào)通路——與學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路、以及與炎癥反應(yīng)相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路。
　　取得的主

7、要研究結(jié)果如下:
　　1.量子點(diǎn)的制備和表征:本研究所用水溶性MPA修飾的CdTe量子點(diǎn)是通過完善而成熟的電化學(xué)方法制備合成。通過水浴低溫反應(yīng)2h和20h分別制備獲得了平均直徑為2.2nm和3.5nm的CdTe量子點(diǎn)，分別發(fā)射綠色和紅色熒光。經(jīng)各種理化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，制備的CdTe量子點(diǎn)光學(xué)性能良好，熒光強(qiáng)度至少可保持四周不變。電鏡結(jié)果顯示量子點(diǎn)呈球形、顆粒分散均勻、穩(wěn)定性良好。兩種量子點(diǎn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中均帶負(fù)電。表明制備的水溶性MPA修

8、飾的CdTe量子點(diǎn)達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，可滿足本研究的所有實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.秀麗線蟲研究表明:CdTe量子點(diǎn)暴露可以損傷秀麗線蟲的運(yùn)動(dòng)行為、攝食能力、化學(xué)趨向性學(xué)習(xí)能力和溫度趨向性記憶能力，并且量子點(diǎn)暴露72h造成的毒性效應(yīng)比24h明顯(P＜0.05)。而這些毒性效應(yīng)發(fā)生的原因與CdTe量子點(diǎn)可以影響編碼神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、五羥色胺和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和受體的基因表達(dá)量有關(guān)。此外，CdTe量子點(diǎn)暴露的線蟲體內(nèi)ROS生成量的顯著增加，可見量子點(diǎn)導(dǎo)

9、致的氧化應(yīng)激與染毒線蟲表現(xiàn)出的神經(jīng)行為毒性反應(yīng)也密切相關(guān)。但是，由于生物體神經(jīng)傳導(dǎo)的復(fù)雜性和相關(guān)基因的多元性，CdTe量子點(diǎn)對(duì)生物體神經(jīng)系統(tǒng)可能造成的毒性效應(yīng)以及毒作用機(jī)制需要用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.體外研究表明:CdTe量子點(diǎn)可以顯著降低原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活性，促進(jìn)其凋亡，具有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。這些毒性效應(yīng)的發(fā)生可能是由于CdTe量子點(diǎn)促進(jìn)神經(jīng)元胞內(nèi)ROS過量生成，從而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和胞內(nèi)鈣失衡導(dǎo)致的

10、。通過抗氧化劑NAC驗(yàn)證了ROS過量產(chǎn)生是CdTe量子點(diǎn)造成細(xì)胞毒性的作用機(jī)制之一。而對(duì)于作用機(jī)制更為復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，除了可以通過CdTe量子點(diǎn)造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)來解釋，還通過神經(jīng)電生理學(xué)經(jīng)典的膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，CdTe量子點(diǎn)增加了細(xì)胞膜上被激活的HVA鈣通道的數(shù)量，同時(shí)抑制其失活，從而促進(jìn)鈣離子從胞外流向胞內(nèi)。CdTe量子點(diǎn)還可以增加鈉通道的電流幅度，加速鈉通道的激活和失活，減緩了其失活后恢復(fù)，通過細(xì)胞膜上

11、鈣鈉交換活動(dòng)，間接促進(jìn)胞外鈣離子內(nèi)流，而神經(jīng)元內(nèi)嚴(yán)重的鈣穩(wěn)態(tài)失衡將不可避免地造成神經(jīng)元損傷。但是，基于體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力仍然不夠，還需用CdTe量子點(diǎn)對(duì)活體動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)毒性效應(yīng)進(jìn)行研究。
　　4.體內(nèi)研究表明:用大鼠海馬體在體注射CdTe量子點(diǎn)的方法，模擬量子點(diǎn)定向給藥，并使得CdTe量子點(diǎn)在大鼠海馬體成功聚集。該染毒方式避免了量子點(diǎn)結(jié)合的生物分子可能對(duì)其生物效應(yīng)的影響，選擇了與前期研究同樣的CdTe量子點(diǎn)，保

12、證了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的連貫性。CdTe量子點(diǎn)暴露可以導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)效率和空間記憶能力出現(xiàn)一定的損傷，這可能與在大腦海馬區(qū)觀察到的病理學(xué)變化以及神經(jīng)元和突觸連接上超微結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得了CdTe量子點(diǎn)造成神經(jīng)毒性可能作用的靶點(diǎn)基因。根據(jù)這些調(diào)控基因提供的生物學(xué)信息，進(jìn)一步完善分析了CdTe量子點(diǎn)造成海馬體毒性效應(yīng)參與的Toll樣受體信號(hào)通路的作用機(jī)制。表明CdTe量子點(diǎn)暴露可以通過抑制PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通

13、路的關(guān)鍵生物分子蛋白AKT和ERK1/2的磷酸化，直接或間接下調(diào)核蛋白c-FOS表達(dá)，損傷突觸可塑性，抑制LTP的形成，從而影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)。此外，CdTe量子點(diǎn)還可以激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞中的MyD88/TLR2/NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎性因子IL-1β增加，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。
　　鑒于目前有關(guān)量子點(diǎn)神經(jīng)毒性的研究十分有限，本論文旨在揭示CdTe量子點(diǎn)對(duì)大鼠海馬體的生物

14、效應(yīng)和參與的毒性作用途徑。本論文不但明確了CdTe量子點(diǎn)對(duì)體外海馬神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞以及模式生物神經(jīng)系統(tǒng)和大鼠海馬體的毒性效應(yīng)，并驗(yàn)證了CdTe量子點(diǎn)造成這些毒作用參與的途徑，例如ROS生成、神經(jīng)傳導(dǎo)損傷等。此外，還用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)CdTe量子點(diǎn)毒性效應(yīng)可能參與的Toll樣受體信號(hào)通路進(jìn)行了較完整的研究。希望本研究的一系列指標(biāo)可以作為毒理學(xué)觀察終點(diǎn)來評(píng)價(jià)量子點(diǎn)的神經(jīng)毒性，并能夠?yàn)楹罄m(xù)量子點(diǎn)更為深入的神經(jīng)毒性的研究提供有價(jià)值的參考。