大西洋表層海水烷烴降解菌及其烷烴羥化酶CYP153A基因的多樣性分析.pdf

1、當前，海洋的石油污染正在日趨加劇，對海洋環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成了長期和惡劣的影響。利用微生物的降解作用來主動清除溢油是當今非常重要的環(huán)境生物修復技術。因此，烷烴降解菌的分離、鑒定及其降解機制（烷烴羥化酶）的研究，無論是作為基礎研究還是應用研究都有著非常重要的意義。 本論文以柴油和原油混合物（1：1）為碳源，采用了單菌分離培養(yǎng)和DGGE相結(jié)合的方法研究了20個橫跨大西洋的表層海水樣品的石油降解菌組成。經(jīng)過富集培養(yǎng)，從20個石油降解菌

2、群中分離篩選得到197株不同細菌，分屬于48個屬，表現(xiàn)出了很高的種屬豐度。降解菌群中可培養(yǎng)菌的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，變形菌綱、放線菌類群、CFB類群以及厚壁菌門的細菌組成了該海域特定的微生物生態(tài)群落，其中尤以變形菌綱α和γ亞群數(shù)目居多。此外，還分離到了33株潛在的新種。PCR—DGGE分析表明，20個菌群中可培養(yǎng)優(yōu)勢降解菌為Alcanivorax、Thalasspospira、Marinobacter、Novosphin

3、gobium、Salinisphaera、Erythrobacter和Parvibaculum，未培養(yǎng)優(yōu)勢菌主要仍為Alcanivorax和Thalasspospir屬菌，其次為Salinisphaera、Bortnella和Zymomona屬菌等。單菌驗證結(jié)果表明，大部分細菌都具有較好的柴油降解能力。其中，Salinisphaera屬菌為潛在的新的烷烴降解菌。此外，Halomonas、Tistrella和Martelella屬菌在這些

4、菌群中也經(jīng)常出現(xiàn)，但并不作為菌群的優(yōu)勢菌存在，單菌油降解能力都很弱。而Bortnella和Zymomona屬菌雖然是菌群優(yōu)勢菌，但都未能獲得純培養(yǎng)。此外，還分離篩選得到1株能夠很好降解C10～C36直鏈烷烴的Gordonia菌株S14—10，根據(jù)16S rRNA基因、看家基因secAl和生理生化特性初步確定其為該屬的一個新種，同時還克隆分析其烷烴降解基因alkB和P450。 通過設計簡并引物，從19個屬的68株細菌中擴增獲得了

5、87個烷烴羥化酶CYP153 P450基因片段。其中，12個屬的細菌為首次發(fā)現(xiàn)含有P450基因，包括Bacillus、Brachybacterium、Halomonas、Idiomarina、Leifsonia、Martelella、Mesorhizobium、Ochrobactrum、Salinisphaera、Sphingobium、Tetrathiobacter、Tistrella以及Solimonas屬。系統(tǒng)進化分析表明，這些P

6、450序列多種多樣，形成多個進化分枝，其中多數(shù)與Alcanivorax來源的P450同源性較高。Salinisphaera屬菌里擴增到的P450基因較為新穎，在進化樹上聚成了一個獨立的小分支。此外，許多進化關系較遠的菌株都擴增到了相同或者相近的P450基因，體現(xiàn)了基因的水平轉(zhuǎn)移。再者，Parvibaculum、Erythrobacter、Sphingobium、Tistrella、Bacillus屬的10株菌還發(fā)現(xiàn)了存在多個P450基因

7、。 本文還對分離自不同海域的11株Parvibaculum屬細菌，以16S rRNA、看家基因rpoD以及重復PCR為基礎進行了系統(tǒng)的分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些16S rRNA和rpoD序列相近的菌株其重復PCR帶型差異較大，說明了重復PCR技術的可靠性與靈敏性，同時也反映了其生境不同而造成的進化上的差異。此外，本文對該屬11株菌的CYP153 P450基因PCR產(chǎn)物進行克隆文庫分析，發(fā)現(xiàn)每株菌都包含4～6個P450序列。實時熒光

8、定量PCR分析表明，菌株Parvibaculum sp. S18—4的6個P450基因中只有P450—2和P450—4能在Clo和C14烷烴誘導下上調(diào)表達，其它基因不表達或下調(diào)表達。它們是否編碼有功能的烷烴羥化酶、是否負責其它底物的降解還有待下一步實驗驗證。 本論文對橫跨大西洋的表層海水樣品中的20個石油降解菌群進行了系統(tǒng)的研究，獲得了豐富的石油烴降解微生物以及降解基因資源。這些結(jié)果有助于我們了解石油在海洋環(huán)境中的歸宿，也為進