腎集合管形態(tài)發(fā)生三維可視化及轉(zhuǎn)運(yùn)功能與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、目的：腎臟集合管系統(tǒng)是由胚胎時(shí)期一個(gè)簡(jiǎn)單的上皮芽，即輸尿管芽(UB)，反復(fù)分支形成。哺乳動(dòng)物腎臟的發(fā)生始于UB的侵入，是UB與后腎間充質(zhì)(MM)相互作用的結(jié)果。MM誘導(dǎo)UB的侵入、分支和生長(zhǎng)。與此同時(shí)，UB誘導(dǎo)MM在其末端聚集，通過(guò)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)分化形成腎單位。腎單位通過(guò)連接小管(CNT)匯入U(xiǎn)B，即成熟分化后的集合管。集合管在皮質(zhì)內(nèi)經(jīng)歷最后一級(jí)分支，形成兩支初始集合小管(ICT)。在匯入集合管的過(guò)程中，一部分腎單位會(huì)共用一個(gè)CNT，形成

2、弓形管(Arcade)與ICT相連，其余腎單位則直接匯入ICT。普遍認(rèn)為，UB末端反復(fù)二權(quán)分支(Branching)是成年腎集合管樹(shù)狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生基礎(chǔ)，UB分支數(shù)目決定了腎單位的數(shù)目，即UB末端形成的分支越多，誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎單位數(shù)目則越多。由于腎單位具有血壓調(diào)節(jié)能力，因此當(dāng)發(fā)育異常或缺陷引起UB末端分支減少時(shí)，腎單位數(shù)量的減少極有可能在成年時(shí)期誘發(fā)腎源性高血壓以及腎衰竭。然而，迄今還沒(méi)有一項(xiàng)研究證明腎單位的數(shù)目與UB分支數(shù)目存在著固定比

3、例關(guān)系。這是由于在UB發(fā)育過(guò)程中，其二杈分支的模式尤其是在腎發(fā)生晚期出現(xiàn)了一些復(fù)雜變化，使體內(nèi)及體外研究都面臨局限性。正因如此，分支機(jī)制的研究雖已延續(xù)數(shù)十年，仍尚無(wú)定論。上世紀(jì)60年代顯微解剖研究發(fā)現(xiàn)，人類胚胎腎臟中UB的末端分支模式并不貫穿腎臟發(fā)生的全過(guò)程:隨后的研究也證實(shí)，當(dāng)UB分支的末端與誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎單位相連，就終止了UB末端的繼續(xù)分支。除了末端分支，近期研究發(fā)現(xiàn)，在腎發(fā)生早期，還存在另一種發(fā)生頻率較低的分支模式，即出芽(Spro

4、uting)。不同于分支，出芽是指從一個(gè)已經(jīng)存在的主干等間距或者隨機(jī)產(chǎn)生側(cè)枝。出芽模式通常決定器官的小葉結(jié)構(gòu)，比如在乳腺、唾液腺和胰腺，而這種分支模式也被認(rèn)為在血管包括毛細(xì)血管網(wǎng)的發(fā)生發(fā)育中存在。因此，從緊密調(diào)節(jié)腎單位發(fā)生，確保腎單位數(shù)量的角度，在腎發(fā)生的晚期，腎集合管樹(shù)的形成可能需要出芽模式形成芽泡，并誘導(dǎo)腎單位的發(fā)生。UB最早分化形成芽泡頂端(Tip)和莖(Stalk)，兩者在基因表達(dá)模式上有明顯區(qū)別。許多芽泡表達(dá)的特定基因都參與U

5、B生長(zhǎng)和分支，而莖部特異性基因在集合管的成熟中發(fā)揮作用，比如離子通道的形成。莖進(jìn)一步延伸分化形成干(Trunk)， UB干部呈現(xiàn)分化更為成熟的表型。當(dāng)UB分化成熟為集合管系統(tǒng)時(shí)，上皮細(xì)胞形成兩種不同的類型----主細(xì)胞和閏細(xì)胞。閏細(xì)胞有A型、B型和NonA-NonB三種亞型，其中NonA-NonB型閏細(xì)胞在不同種屬中分布比例和微細(xì)結(jié)構(gòu)均有所不同。三種亞型閏細(xì)胞皆有質(zhì)子ATP酶(H+-ATPase)的表達(dá)。在細(xì)胞功能分化過(guò)程中，主細(xì)胞的水

6、通道蛋白-2(AQP-2)是集合管細(xì)胞首先表達(dá)的標(biāo)志蛋白之一。一些結(jié)構(gòu)蛋白如Claudin-7，在發(fā)育集合管上有較豐富的表達(dá)，作為緊密連接蛋白Claudin家族的成員，它在建立上皮屏障以及旁分泌轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，成熟的集合管在應(yīng)對(duì)代謝變化時(shí)可以重塑其細(xì)胞群，如主細(xì)胞和閏細(xì)胞，且在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞類型表現(xiàn)出相當(dāng)大的可塑性和互變現(xiàn)象。在集合管上皮形成過(guò)程中，兩種細(xì)胞在數(shù)量比例、形態(tài)及功能方面的正常分化，對(duì)于腎臟正常發(fā)育

7、、機(jī)體水鹽及酸堿平衡調(diào)節(jié)等生理功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。本研究在組織學(xué)連續(xù)切片并染色基礎(chǔ)上，采用計(jì)算機(jī)可視化技術(shù)，以成年集合管樹(shù)空間結(jié)構(gòu)及其與腎單位相連的特殊排列順序做為形態(tài)參照，對(duì)胚胎(E)14.5，E17.5，生后(P)7天UB樹(shù)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行推演比較，并結(jié)合更多時(shí)間點(diǎn)二維圖像的觀察，分析集合管樹(shù)（早期的UB）形態(tài)發(fā)生的過(guò)程以及可能存在的分支模式。此外，在發(fā)育集合管三維可視化基礎(chǔ)上，對(duì)其上皮的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)功能(AQP-2及H+-ATP

8、ase的表達(dá))，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)旁路的屏障結(jié)構(gòu)（Claudin-7表達(dá)），以及UB增殖狀態(tài)（增殖細(xì)胞核抗原PCNA表達(dá)）等分別進(jìn)行了研究，旨在探索集合管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能成熟的時(shí)空規(guī)律。
　　方法：⑴獲取小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織2.5μm厚樹(shù)脂(E17.5，P7，P56)或5μm厚石蠟(E14.5，P1，P5)連續(xù)切片。采用圖像采集系統(tǒng)將連續(xù)切片轉(zhuǎn)為數(shù)字顯微圖像后，經(jīng)自編軟件配準(zhǔn)，再輸入到計(jì)算機(jī)Linux系統(tǒng)，采用定制的C語(yǔ)言程序?qū)崿F(xiàn)小管的數(shù)

9、字追蹤。集合管的追蹤始于腎乳頭管，止于腎單位遠(yuǎn)端小管。腎小管的追蹤始于匯入集合管的腎單位的遠(yuǎn)端部分，止于腎小體尿極近端小管。將追蹤得到的坐標(biāo)數(shù)據(jù)集輸入到三維可視軟件中，顯示并分析集合管分支的空間走行及其與腎小管的毗鄰關(guān)系。⑵在集合管走行可視化基礎(chǔ)上，取代表皮質(zhì)及髓質(zhì)多個(gè)平面的2.5μm厚樹(shù)脂切片，樹(shù)脂再包埋，獲取50nm超薄切片，透射電鏡下，與成鼠集合管對(duì)比觀察發(fā)育過(guò)程中集合管超微結(jié)構(gòu)。⑶選取連續(xù)石蠟切片中目標(biāo)切片，采用改良的免疫組織化

10、學(xué)方法，檢測(cè)發(fā)育腎集合管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)旁路的屏障結(jié)構(gòu)蛋白Claudin-7，以及主細(xì)胞和閏細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白AQP-2和H+-ATPase的表達(dá)，觀察兩種細(xì)胞的分布并計(jì)數(shù)集合管上皮細(xì)胞中主細(xì)胞所占百分比。此外，利用PCNA與AQP-2免疫熒光雙標(biāo)染色，在腎組織不同區(qū)域計(jì)數(shù)集合管兩種細(xì)胞的增殖指數(shù)。
　　結(jié)果：①UB的所有分支都是在MM區(qū)域形成（包括生腎區(qū)）;UB侵入后的MM變成梯狀的間充質(zhì)。②E14.5時(shí)UB樹(shù)狀雛形已基本構(gòu)建，其中，UB

11、在6～9級(jí)分支時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)腎單位;從E14.5到E17.5，UB至少又經(jīng)歷兩次分支;而到了P7，UB系統(tǒng)已基本具有成年鼠腎的集合管模式。③與以往觀察不同的是，UB末端分支在貫穿整個(gè)腎單位發(fā)生過(guò)程中，形成的兩端芽泡都與腎單位相連（而不是一端誘導(dǎo)腎單位，另一端繼續(xù)分支）。通常兩側(cè)連接的腎單位的發(fā)育階段略有先后。連接腎單位的數(shù)目在早期（如E14.5）多為一個(gè)，出生前后（如E17.5）則常見(jiàn)一個(gè)芽泡誘導(dǎo)形成兩個(gè)腎單位。④發(fā)育至成年，與皮質(zhì)集合管相

12、連的ICT、弓形管及腎單位出現(xiàn)了較為規(guī)律的時(shí)空排列順序：弓形管連有4～5個(gè)腎單位，其中，最早發(fā)生的腎單位（腎小體位于近髓質(zhì)的皮質(zhì)）總是連在弓形管的最遠(yuǎn)端（連接處距離腎被膜最遠(yuǎn)）；隨后發(fā)生的腎單位則依序由遠(yuǎn)至近連在弓形管近側(cè)端（離腎被膜近）；弓形管連接一支ICT，在中間皮質(zhì)淺層匯入皮質(zhì)集合管；另一支ICT在被膜下的皮質(zhì)中走行一段距離，且與2～3個(gè)淺層皮質(zhì)腎單位相連，其最末端連著最晚發(fā)生的腎單位。⑤UB芽泡與UB莖上皮細(xì)胞呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的差異性

13、。芽泡細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，呈楔形，排列緊密，核漿比例大，期間偶見(jiàn)“亮”細(xì)胞;與此相比，鄰近的芽莖細(xì)胞相對(duì)較矮小，排列較緊密，管腔較小，散在“亮”細(xì)胞，而整個(gè)UB干部細(xì)胞在腎臟不同區(qū)域呈現(xiàn)多形性。E17.5電鏡觀察，芽泡細(xì)胞電子密度高，細(xì)胞器散在分布，主要為小而密集的線粒體、豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體;UB莖和干部上皮細(xì)胞電子密度則有明顯的高低之分，但尚無(wú)主細(xì)胞和閏細(xì)胞的典型超微結(jié)構(gòu)特征。P7電鏡觀察顯示，在集合管(發(fā)育后期的

14、UB)上已有較成熟的閏細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，如游離面的微絨毛、胞質(zhì)中的小泡、散在的線粒體等，但尚未形成典型的主細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如基底的質(zhì)膜內(nèi)褶。⑥Claudin-7在早期UB包括芽泡和莖的上皮細(xì)胞基側(cè)面，均有表達(dá)。與之不同的是，UB芽泡在腎發(fā)生終止前(P5)，始終沒(méi)有AQP-2和H+-ATPase的表達(dá);而UB莖的上皮細(xì)胞在E17.5已有兩種蛋白的表達(dá)。其中，AQP-2陽(yáng)性標(biāo)記的主細(xì)胞所占集合管上皮細(xì)胞的比例(％)在皮質(zhì)、外髓和內(nèi)髓分別為70.58±

15、4.07、77.11±1.45、90.85±0.61，這種趨勢(shì)一直保持到成年。⑦集合管上皮細(xì)胞增殖指數(shù)，隨著小鼠腎組織的發(fā)育呈降低趨勢(shì)，在這下降過(guò)程中，集合管細(xì)胞在皮質(zhì)中的增殖指數(shù)高于外髓;在皮質(zhì)中，主細(xì)胞的增殖指數(shù)高于閏細(xì)胞;而在外髓中，主細(xì)胞增殖指數(shù)在P7時(shí)高于閏細(xì)胞，發(fā)育至成年則與閏細(xì)胞增殖指數(shù)相當(dāng)，均較低。
　　結(jié)論：⑴通過(guò)對(duì)比成年集合管樹(shù)空間結(jié)構(gòu)、形態(tài)及其與腎單位相連的特殊排列順序，發(fā)生發(fā)育UB形態(tài)發(fā)生的三維可視化結(jié)果提

16、示:UB發(fā)育形成弓形管后，以出芽方式誘導(dǎo)腎單位的形成，同時(shí)，也以出芽方式形成另一支ICT，后者在生腎區(qū)繼續(xù)以出芽方式形成新的芽莖和芽泡并誘導(dǎo)腎單位，直到生后5天腎單位停止發(fā)生。⑵根據(jù)上述UB出芽誘導(dǎo)腎單位發(fā)生的模式、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析，芽泡和芽莖構(gòu)成成年腎臟CNT的主要來(lái)源。但在腎單位發(fā)生停止之前(P5)，芽泡并不具有成年集合管的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而此時(shí)芽莖具有成年集合管相同但較弱的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，盡管其典型形態(tài)結(jié)構(gòu)特征尚未形成。而整個(gè)U