IGF-1通過線粒體信號途徑對感覺神經再支配骨骼肌結構和功能維持的作用.pdf

1、骨骼肌(skeletal muscle，SKM)正常結構和功能的維持是保證人體正常運動狀態(tài)的最基本條件，蛋白合成和降解平衡的穩(wěn)定維持著SKM的正常結構和功能，而這一平衡狀態(tài)的維持有賴于正常的神經支配。當失神經支配時SKM蛋白合成與降解的平衡被打破，導致肌萎縮，并伴有一系列嚴重的臨床癥狀，如運動功能的喪失。在運動神經損毀嚴重等特殊情況下，SKM的神經支配無法及時恢復，長時間的運動神經支配缺失會導致SKM收縮功能的喪失，即使SKM再次得到運

2、動神經支配，其運動功能也無法恢復。因此，盡快恢復失神經SKM的神經支配至關重要。將感覺神經近側端與運動神經遠側殘端連接的感覺保護成為保護無法及時恢復運動神經支配SKM的一種方案，但感覺保護的作用較弱，其治療效果有待進一步加強。體內和體外的實驗均證實胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）作為一種多功能的多肽類生長因子，可通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol

3、3-kinase，PI3K)/Akt信號通路延緩多種病理性肌萎縮并維持和促進神經系統(tǒng)的生長及存活，但IGF-1對SKM感覺保護是否有增強作用尚有待證實。已有研究表明，Akt激活能夠影響線粒體的功能狀態(tài)，而線粒體的功能與其形態(tài)密切相關，線粒體在分裂和融合狀態(tài)之間持續(xù)轉換，線粒體的異常形態(tài)會導致多種疾病。但IGF-1對SKM感覺保護模型中線粒體的影響尚無相關研究。本課題通過建立在體感覺神經支配動物模型和具有感覺神經支配的SKM細胞體外聯(lián)合培

4、養(yǎng)模型，研究IGF-1對SKM感覺保護的作用及相關機制，本課題的研究結果將會為延緩失神經肌萎縮的治療提供新的理論基礎和實驗依據。
　　第一部分：IGF-1增強在體感覺神經再支配對骨骼肌的保護作用
　　如果SKM失去運動神經支配的時間過長，即使SKM再次獲得神經支配，其運動功能也將無法恢復。在運動神經損傷嚴重，無法及時恢復SKM神經支配時，可將感覺神經與運動神經殘端連接進行修復，使失神經支配SKM得到臨時的感覺神經支配，這種技

5、術手段被稱為感覺保護。雖然運動功能仍無法恢復，但感覺保護可保護SKM的收縮功能及重要結構，待運動神經恢復至能夠正常修復后，再將運動神經近側與遠側殘端連接，使SKM運動功能逐步恢復。但感覺保護對失神經SKM的作用程度有限，效果有待加強。IGF-1作為一種多功能多肽類因子，對SKM和神經系統(tǒng)均具有保護作用，但IGF-1能否增強SKM感覺保護的作用尚有待于進一步研究。mtDNA數量的變化與線粒體正常功能的維持密切相關，而這種變化與SKM的功能

6、有密切的關系，而這些變化過程中IGF-1所扮演的角色，目前也不清楚?；谝陨涎芯勘尘埃菊n題設計如下實驗進行研究。取25只260±10 g的Wistar雄性大鼠，采用隨機分組的方法分為:(1)假手術組:在大鼠后肢作縱行切口，顯露坐骨神經分叉部后縫合;(2)失神經組:做同樣切口后離斷脛神經，近側殘端結扎并縫入塑料帽后縫合;(3) IGF-1組:手術操作同失神經組，脛神經離斷后縫合刀口，術后8w時間內每3d向腓腸肌多點注射10μgIGF-1

7、;(4)感覺保護組:作縱行切口后離斷脛神經和腓腸神經，將腓腸神經的近側殘端和脛神經的遠側殘端縫合，脛神經的近側殘端同樣縫合到塑料帽中，縫合刀口;(5) IGF-1+感覺保護組，手術操作同感覺保護組，IGF-1應用時間、部位及劑量同IGF-1組。術后8 w收集腓腸肌組織樣本進行相關檢測。結果表明，對肌萎縮最為直觀反映為肌濕重和肌橫截面積(cross-sectional area，CSA)，在失神經組出現(xiàn)顯著下降，IGF-1組和感覺保護組增

8、加，而IGF-1+感覺保護組增加的幅度最大。SKM關鍵收縮蛋白肌球蛋白重鏈1(myosin heavy chain1，MyHC1)變化趨勢與腓腸肌肌濕重和肌橫截面積相一致，失神經組下降最明顯，而IGF-1增強了SKM感覺保護的作用，使IGF-1+感覺保護組的MyHC1表達量較感覺保護組進一步提高。同時，IGF-1不僅能夠直接提升失神經SKM線粒體含量，而且IGF-1還可進一步增強感覺神經再支配對線粒體含量的上調作用。以上結果表明，感覺神

9、經保護可延緩大鼠失神經肌萎縮和線粒體數量的減少，在感覺神經保護的基礎上應用IGF-1后，可使感覺神經保護延緩肌萎縮和線粒體數量減少的作用得到明顯增強。上述實驗結果為進一步探討IGF-1對SKM感覺保護的增強作用提供了實驗依據和新的思路。
　　第二部分：IGF-1對具有感覺神經支配的骨骼肌細胞保護作用的體外培養(yǎng)研究
　　維持SKM正常運動功能的神經支配的發(fā)生、發(fā)展和作用過程是極其復雜的。失神經支配的SKM會即刻喪失其應有的運動

10、功能，而且還由于神經營養(yǎng)作用的缺失而導致SKM很快就會出現(xiàn)萎縮。為了研究延緩失神經支配SKM的策略，本課題利用具有背根神經節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經元感覺神經支配的SKM細胞模型，研究外源性IGF-1對SKM細胞直接作用或通過作用于支配SKM細胞的感覺神經而改善SKM細胞狀態(tài)的新的治療策略。在Wistar新生鼠后肢SKM細胞培養(yǎng)2d后，取15d胎鼠器官型DRG來建立DRG組織塊和分散SKM細胞的聯(lián)合培養(yǎng)體

11、系，此培養(yǎng)體系將繼續(xù)培養(yǎng)4d。本課題的實驗分組為:(1)對照組（SKM組），SKM細胞在SKM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d后更換為共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 d;(2)聯(lián)合培養(yǎng)組，單純SKM細胞培養(yǎng)2d后加入DRG組織塊繼續(xù)共培養(yǎng)4d;(3) SKM+IGF-1組，SKM細胞在培養(yǎng)2d后，更換為共培養(yǎng)體系使用的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，然后在共培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1(20 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)2 d;(4)聯(lián)合培養(yǎng)+IGF-1組，單純SKM細胞培養(yǎng)2d

12、后，與DRG組織塊共培養(yǎng)2d，此后在聯(lián)合培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)2d。通過免疫熒光標記檢測SKM細胞的長度和表面積以衡量細胞生長狀態(tài)，通過檢測SKM關鍵收縮蛋白MyHC1的表達量以間接反映SKM細胞的收縮潛能，檢測mtDNA/nuDNA比值代表線粒體數量的變化，用MitoTrackerRed活體染料標定線粒體的形態(tài)，檢測胞漿細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)表達量德量線粒體完整性。結果顯示，IGF-1可直接作用

13、于SKM細胞或通過作用于DRG感覺神經元而間接影響SKM細胞的生長狀態(tài);IGF-1可通過影響SKM細胞收縮性蛋白MyHC1的表達來改善SKM細胞的功能狀態(tài);IGF-1對SKM細胞線粒體數量、線粒體分裂/融合的動態(tài)平衡以及線粒體完整性的維持等多個方面具有重要的促進作用。以上結果表明，作為單因素作用的感覺神經支配或IGF-1可對培養(yǎng)的SKM細胞狀態(tài)具有一定的影響作用，聯(lián)合應用感覺神經保護和IGF-1對SKM細胞的效果更為明顯。本課題的研究結

14、果為IGF-1對感覺保護的作用提供新的資料和觀點，為SKM細胞狀態(tài)和線粒體之間的關系補充了新的實驗資料和依據。
　　第三部分IGF-1保護具有感覺神經支配的骨骼肌細胞的線粒體信號途徑
　　IGF-1和感覺神經支配對失神經SKM具有確定的保護作用，對于長時間失神經支配SKM運動功能的恢復具有重要的指導意義，尤其是IGF-1通過增強感覺神經支配信號而對SKM細胞的間接作用研究策略是本研究領域的一個重要發(fā)展方向，但IGF-1的這種

15、保護作用機制仍不清楚。但由于失神經支配SKM狀態(tài)變化和功能喪失的嚴重性表現(xiàn)在多個方面，又由于IGF-1信號通路對SKM細胞作用靶點的不確定性，致使IGF-1通過增強感覺神經支配信號改善SKM細胞狀態(tài)的機制探索帶來了一定的難度。本課題利用具有DRG神經元感覺神經支配的SKM細胞模型，通過檢測IGF-1激活的Akt通路及下游的相關靶點，并運用相應的激活/抑制劑和過表達載體研究相應的機制。結果表明，感覺神經支配并沒有激活SKM細胞的Akt通路

16、，感覺神經保護對SKM細胞的改善可能是通過其他途徑來實現(xiàn)的。但IGF-1對感覺神經-肌聯(lián)合培養(yǎng)的SKM細胞Akt磷酸化水平則有顯著的上調作用。通過用LY294002抑制Akt磷酸化，進一步確認Akt磷酸化水平的上調是IGF-1誘導的線粒體數量增加、線粒體融合增多、線粒體完整性改善、蛋白水解泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)中泛素連接酶atrogin-1和肌環(huán)指蛋白Ⅰ(muscle RING

17、finger1，MuRF1)抑制、MyHC1蛋白表達量上升的關鍵步驟。與未給予IGF-1的感覺保護組相比，應用IGF-1的感覺保護組SKM的Akt磷酸化水平的上調抑制了線粒體外膜蛋白線粒體E3泛素蛋白連接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin proteinligase1，Mul1)的表達。為進一步確認Mul1在Akt對線粒體及下游改變中發(fā)揮的作用，通過構建Mul1過表達載體，應用于IGF-1孵育的聯(lián)合培養(yǎng)體系內，證

18、實了Mul1過表達可抑制SKM細胞的Akt磷酸化水平升高誘導的線粒體狀態(tài)的改善、蛋白降解途徑抑制和SKM收縮蛋白表達的上調，確認了Mul1可能為IGF-1下游作用于線粒體的重要靶點。IGF-1抑制Mul1，使SKM細胞線粒體狀態(tài)改善，能量產生增多，從而抑制了線粒體下游能量感受器5-磷酸腺苷依賴的蛋白激酶α(adenosine5'-monophosphate-activated protein kinaseα，AMPKα)的活化。通過應用

19、1 mmol/L AMPKα激活劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-D-核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carbox-amide-1-D-ribonucleoside，AICAR)，進一步確認IGF-1改善線粒體能量產生后，抑制AMPKα活化，進而減少atrogin-1mRNA、MuRF1 mRNA表達和促進MyHC1蛋白表達。本課題的研究結果明確了在神經-肌聯(lián)合培養(yǎng)體系中IGF-1對線粒體功能形態(tài)和SKM細胞狀態(tài)的進一步

20、促進作用的機制。IGF-1通過對其下游靶點Akt、Mul1以及AMPKα的調控來改善感覺神經再支配SKM細胞的狀態(tài)。該途徑的主要調控機制為IGF-1誘導Akt磷酸化和抑制Mul1的表達，從而改善線粒體形態(tài)及功能狀態(tài)，最終通過抑制UPS關鍵分子atrogin-1和MuRF1的表達來增加收縮性蛋白MyHC1的合成。這些數據為通過調控IGF-1信號通路及線粒體改善長期失神經SKM細胞的功能狀態(tài)提供了全新的實驗依據，同時也為該途徑的關鍵分子的研