Repair of the Osteonecrosis of the Femoral Head with Magnesium Alloy Rod Transfected Bone Morphogenetic Protein-2.pdf

1、目的:
　　股骨頭壞死(Avascular Necrosis of Femoral Head，ANFH))是由于多種病因造成股骨頭血液循環(huán)障礙，部分或完全性缺血，導(dǎo)致骨細胞、骨髓造血細胞、脂肪細胞等活力成分變性和死亡，骨小梁斷裂，壞死區(qū)的力學(xué)強度逐漸下降，引起股骨頭塌陷，最終形成嚴重的骨關(guān)節(jié)炎。髖關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、激素過量使用和乙醇中毒是股骨頭壞死常見的病因。近年來，隨著對股骨頭壞死研究的不斷深入以及骨髓干細胞的應(yīng)用，使股骨頭壞死的治療有

2、了新的進展。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMSCs)來源于中胚層，具有多向分化潛能。在特定的條件下，可定向分化為骨細胞、軟骨細胞和血管內(nèi)皮細胞等。同時還可分泌多種成骨活性因子，與骨組織再生和創(chuàng)傷愈合創(chuàng)造了有利條件，體內(nèi)外研究顯示在骨與軟組織損傷修復(fù)方面顯示出良好應(yīng)用前景。同時，動物實驗已證實:全身或局部注入人胚胎骨髓間充質(zhì)干細胞和自體骨髓間充質(zhì)干細胞很少發(fā)生移植排斥

3、反應(yīng)。由于外源性生長因子半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝，須反復(fù)使用，從而帶來一些問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在不影響細胞特殊表型的前提下，將編碼生長因子的基因?qū)肽康募毎?。有研究通過基因表達產(chǎn)生內(nèi)源性生物活性物質(zhì)，調(diào)控細胞自身增殖分化，將細胞治療和基因治療結(jié)合起來，應(yīng)用于組織工程修復(fù)股骨頭壞死過程，提出了基因加強的組織工程(gene-enhanced tissue engineering)新理念。近年來，已有較多將單一生長因子轉(zhuǎn)入種子細胞并

4、取得較高表達和較好效果的報道。轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細胞的出現(xiàn)明顯提高了干細胞治療股骨頭壞死的療效。
　　骨形態(tài)生成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是一類酸性多肽，屬于TGF-β超家族結(jié)構(gòu)相關(guān)信號蛋白，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞和成骨細胞，具有誘導(dǎo)新骨形成的作用，是目前最重要的新骨形成調(diào)控因子，主要由成骨細胞和瘤性成骨細胞分泌。骨形態(tài)生成蛋白能促進多種細胞的增殖和分化，如成骨

5、細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞，并能誘導(dǎo)骨基質(zhì)的合成，在體外可促進骨髓基質(zhì)細胞的增殖，增強其堿性磷酸酶活性，刺激其分化。BMP-2在體內(nèi)，主要分布于骨膠原纖維、骨膜、骨髓基質(zhì)中，密質(zhì)骨的含量較松質(zhì)骨多。BMP-2是骨形成過程中惟一能獨立誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為骨細胞的調(diào)控因子。研究表明，低濃度的BMP-2可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞移行至骨組織形成部位;中等濃度的BMP-2能促進間充質(zhì)干細胞分化為成軟骨細胞及成骨細胞;高濃度的BMP-2則可促進間充

6、質(zhì)干細胞增生。在臨床上，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)取自于骨髓，手術(shù)操作簡便，來源較充足。大量研究表明，BMP-2與BMSCs在新骨生成過程中具有協(xié)同作用。本實驗將BMP-2基因轉(zhuǎn)染入BMSCs，觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP-2 mRNA和蛋白質(zhì)水平。分析BMP-2基因轉(zhuǎn)染在體外向成骨方向分化的情況。
　　采用植入鉭和鉭合金減壓金屬棒的方法是目前臨床上治療早期股骨頭壞死的一種方法。但鎂和鎂合金的彈性模量和密度比鉭合金更接近骨組織

7、的物理學(xué)性質(zhì)，具有比其他生物金屬材料密度小的優(yōu)點。它的密度接近人體骨組織密度，鎂及鎂合金和人體骨的彈性模量分別為45 GPa和3～20 GPa，由于相近的彈性模量鎂及鎂合金可以減少應(yīng)力遮擋效應(yīng)，減少局部骨質(zhì)疏松的發(fā)生和再骨折現(xiàn)象。由于金屬鎂及鎂合金無磁性，當(dāng)人體攜帶鎂及鎂合金時可以進行核磁共振成像造影，這是金屬鎂及鎂合金在臨床應(yīng)用的優(yōu)勢之一。更重要的是，鎂對人體的很多的新陳代謝有積極作用。在高氯離子的環(huán)境和動物體內(nèi)，鎂和鎂合金材料有良好

8、的生物降解性。鎂是人體新陳代謝重要的原材料，主要通過小腸吸收，在人體中有很多重要的生理功能，是人體中許多酶的輔因子，它能抑制鈣離子在人體內(nèi)的積累，使血液中膽固醇含量降低，對動脈粥樣硬化和心肌梗塞有一定的預(yù)防作用，并且它還能改善心臟的功能，穩(wěn)定生物體內(nèi)DNA和RNA的結(jié)構(gòu)。高濃度的鎂具有毒性，血清鎂水平超過1.05mmol/L可能導(dǎo)致肌肉癱瘓、低血壓、呼吸窘迫。綜上所述，鎂合金良好的力學(xué)特性、生物學(xué)相容性、可降解性和生物活性特征成為新型醫(yī)

9、用植入材料的明星材料。
　　本實驗將骨形態(tài)生成蛋白-2（Bone Morphogenetic protein-2，BMP-2）轉(zhuǎn)染骨髓問充質(zhì)細胞(bone morrow mesenchymal stem cell，BMSCs)，復(fù)合鎂合金金屬棒植入兔股骨頭壞死模型病變部位，通過術(shù)后定期檢測動物生化指標(biāo)、組織學(xué)形態(tài)、影像學(xué)改變，從而評價鎂合金和骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合骨形態(tài)生成蛋白治療兔股骨頭壞死的效果和鎂合金作為植入材料的安全性和有效

10、性。
　　方法:
　　1.液氮冷凍法建立股骨頭壞死模型所有實驗用動物均以右側(cè)股骨頭建立壞死模型。參照臨床上人股骨頭髓芯減壓術(shù)的操作步驟，取俯臥位，采用質(zhì)量分數(shù)3％戊巴比妥腹腔注射(30mg/Kg)的方法進行麻醉;確定股骨頭位置后取外側(cè)切口，切開關(guān)節(jié)囊，充分暴露外旋股骨頭（以未出現(xiàn)髓關(guān)節(jié)脫位為準），然后從外背側(cè)向股骨頭方向直至關(guān)節(jié)軟骨下鉆孔，所用鉆頭直徑為3.5 mm，采用刮匙刮除股骨頭內(nèi)骨質(zhì)的方法造成約50％左右的骨缺損，最

11、后用液氮灌注法持續(xù)冷凍股骨頭大約5 min。
　　2.BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs及鑒定成年新西蘭大耳白兔髂后上嵴抽骨髓組織，種植于細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于DMEM培養(yǎng)基中，37℃、體積分數(shù)5％ CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第三代細胞，分離鑒定BMSCs，采用電轉(zhuǎn)法將BMP-2基因表達載體轉(zhuǎn)染至BMSCs細胞。細胞轉(zhuǎn)染后分成2組，采用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測各組BMSCs的BMP-2基因的mRNA表達水平;采用Western-blot法檢測

12、各組BMSCs的BMP-2蛋白表達水平。隨后復(fù)合于明膠海綿上，在細胞培養(yǎng)箱中孵育4h后備用。
　　3.動物分組用X線片鑒定動物模型，隨機分成空白組（A組）、BMSCs組（B組）、鎂棒/BMSCs組（C組）、鎂棒組（D組）4組，每組10只。動物麻醉成功后，空白組不做處理，BMSCs組植入轉(zhuǎn)染成功的BMSCs，鎂棒/BMSCs組植入鎂棒和轉(zhuǎn)染后的BMSCs，鎂棒組植入鎂棒。所有動物均用右側(cè)股骨頭實驗。
　　4.植入后第6周、第1

13、2周觀察兔股骨頭修復(fù)情況于第6周和第12周每組取兩只動物行HE染色及Masson染色觀察骨小梁生長狀態(tài)。
　　5.植入后第6周、第12周實驗動物的肝、腎、肺毒性及化驗檢查用HE染色對兔肝、腎、肺組織進行組織病理學(xué)觀察。用生化法檢測動物血、尿標(biāo)本的鎂離子濃度。
　　結(jié)果
　　1.BMP-2基因轉(zhuǎn)染及表達鑒定 Western-blot法和RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，外源性BMP-2基因通過體外電轉(zhuǎn)成功轉(zhuǎn)染BMSCs并表達相

14、應(yīng)的mRNA及蛋白。
　　2.動物模型股骨頭X線檢查結(jié)果
　　A組標(biāo)本:術(shù)后6周時，模型側(cè)股骨頭密度降低，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂;術(shù)后12周時，股骨頭密度增高，骨小梁結(jié)構(gòu)不清，軟骨下囊性變。B組標(biāo)本:術(shù)后6周、12周時，骨組織只在鉆孔區(qū)邊緣密度增高，而鉆孔區(qū)內(nèi)骨組織密度無明顯變化。C組標(biāo)本:骨修復(fù)效果明顯較A組、B組好，股骨頭外形恢復(fù)良好，骨密度亦降低;術(shù)后12周時鉆孔區(qū)密度接近周圍骨質(zhì)，股骨頭內(nèi)出現(xiàn)規(guī)則連續(xù)骨小梁，鉆孔邊緣交界區(qū)骨

15、小梁接合良好。D組標(biāo)本:在6周和第12周時，股骨頭可見明顯的骨修復(fù)，但骨密度較低。
　　3.股骨頭組織切片觀察
　　A組標(biāo)本:術(shù)后6周時，模型側(cè)ANFH部位出現(xiàn)較多破骨細胞，骨小梁形狀不規(guī)則，關(guān)節(jié)軟骨面磨損嚴重，少數(shù)模型的關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)塌陷;術(shù)后12周時，關(guān)節(jié)軟骨而磨損現(xiàn)象與修復(fù)現(xiàn)象并存，骨髓纖維化和增生同時可見，骨吸收和軟骨面塌陷被發(fā)現(xiàn)。B組標(biāo)本:術(shù)后4周時，骨缺損處成骨細胞稀少，進而僅鉆孔區(qū)逐漸形成骨髓組織，鉆孔邊緣出現(xiàn)

16、少量類骨質(zhì)及新生骨小梁。16周時其軟骨面的磨損、骨小梁的紊亂以及股骨頭的塌陷都與模型對照組相似。C組標(biāo)本:術(shù)后6周時，骨小梁排列基本規(guī)則，有大量的骨細胞形成;術(shù)后12周時，可見骨小梁排列規(guī)則，飽滿，骨細胞清晰可見，造血細胞豐富，已為正常股骨頭組織學(xué)表現(xiàn)。D組標(biāo)本:對于鎂棒組（D組）骨小梁骨密度較低，僅略高于空白組的骨密度。
　　4.實驗動物的肝腎肺毒性及化驗檢查
　　第6周和第12周兔肝組織HE染色鏡下觀察大部分肝細胞組織形

17、態(tài)正常、肝小葉結(jié)構(gòu)正常;取兔腎組織鏡下觀察未見腎小管細胞壞死，腎小球組織形態(tài)正常取兔肺組織行HE染色鏡下觀察肺組織組織形態(tài)正常、未見肺纖維化。術(shù)后第6周和第12周鎂棒組和鎂棒/BMSCs組靜脈血、尿樣本的鎂離子濃度均在正常范圍內(nèi)。
　　結(jié)論:
　　1.體外電轉(zhuǎn)重組BMP-2表達載體至BMSCs，細胞毒性低，不影響其在支架材料上的增殖和成骨分化。
　　2.BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合鎂金屬棒，可促進兔股骨頭的壞死組織