海洋藥用生物星蟲的資源化學(xué)與效應(yīng)物質(zhì)研究.pdf

1、本論文的研究內(nèi)容主要包括建立特定的分析方法，對(duì)星蟲中的核苷類成分、游離氨基酸類成分，脂肪酸類成分和無機(jī)元素類成分進(jìn)行定性定量檢測以及采用活性跟蹤法對(duì)星蟲中一種具有溶栓作用的活性蛋白——星蟲激酶進(jìn)行提取分離、純化和制備，并對(duì)星蟲激酶作用纖維蛋白和纖維蛋白原的作用機(jī)理、酶學(xué)性質(zhì)、體內(nèi)和體外水平的溶栓活性評(píng)價(jià)以及基于代謝組學(xué)對(duì)星蟲激酶對(duì)動(dòng)脈血栓形成的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　本論文共分三章，各章節(jié)的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　一、

2、文獻(xiàn)研究
　　本部分總結(jié)中外學(xué)者的研究，簡要介紹了星蟲動(dòng)物門的由來、分類和星蟲的一般生理生態(tài)活性特征，并對(duì)星蟲動(dòng)物門的資源利用現(xiàn)狀進(jìn)行分析，肯定了我國在星蟲人工養(yǎng)殖、新藥開發(fā)和利用其作為污染物監(jiān)測方面所取得的成就。重點(diǎn)介紹了星蟲體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)活性物質(zhì)、自身生理活性物質(zhì)和藥理活性物質(zhì)以及星蟲所具有的藥理活性。
　　二、星蟲資源化學(xué)成分評(píng)價(jià)
　?。ㄒ唬┖塑蘸陀坞x氨基酸類成分資源化學(xué)評(píng)價(jià)
　　為了對(duì)星蟲樣品的核苷和

3、游離氨基酸類成分進(jìn)行資源化學(xué)評(píng)估，本實(shí)驗(yàn)采用HILIC-UPLC-TQ-MS/MS同時(shí)測定了不同產(chǎn)地、不同部位及不同方法處理的19批裸體方格星蟲樣品中的共計(jì)16種核苷類成分和25種游離氨基酸類成分。并采用了PCA的分析方法對(duì)各樣品之間的差異進(jìn)行了進(jìn)一步的比較。結(jié)果顯示所建立的測定的方法準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好。41種成分的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.003-0.229μg/mL和0.008-0.763μg/mL

4、。日內(nèi)精密度和日間精密度分別＜3.72％和＜3.42％。重復(fù)性的結(jié)果為＜4.48％，樣品在一天內(nèi)的0、2、4、8、12、24 h的穩(wěn)定性＜4.92％。加樣回收率的結(jié)果為94.03％-106.33％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為＜3.76％。本實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)研究成果將為星蟲資源的深入研究和開發(fā)利用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　?。ǘ┲舅犷惓煞仲Y源化學(xué)評(píng)價(jià)
　　為了對(duì)星蟲樣品的脂肪酸類成分進(jìn)行比較和深入研究，本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)

5、用技術(shù)(GC-MS)對(duì)12個(gè)裸體方格星蟲樣品中的26種脂肪酸進(jìn)行了含量測定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行包括PCA分析在內(nèi)的系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所建立的測定方法檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.028-0.359mg/mL和0.093-1.197mg/mL。精密度和重復(fù)性的結(jié)果范圍分別為0.53％-3.12％和0.18％-3.15％，樣品在一天內(nèi)的穩(wěn)定性范圍為0.78％-3.11％。加樣回收率的結(jié)果的范圍為94.20％-105.36

6、％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)范圍為1.13％-3.30％。對(duì)裸體方格星蟲樣品的測定結(jié)果顯示各樣品26種脂肪酸類成分總含量范圍為198.20-578.05μg/g，總含量最低的樣品是廣西北海的裸體方格星蟲外壁+內(nèi)臟樣品(S9)，總含量最高的樣品是海南三亞的裸體方格星蟲體腔液樣品(S12);每個(gè)產(chǎn)地的裸體方格星蟲的樣本均呈現(xiàn)體腔液部位總含量高于外壁+內(nèi)臟部位。
　?。ㄈo機(jī)元素類成分資源化學(xué)評(píng)價(jià)
　　為了對(duì)星蟲樣品的無機(jī)元素類

7、成分進(jìn)行比較和深入研究，本實(shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)對(duì)采自7個(gè)產(chǎn)地的12個(gè)裸體方格星蟲樣品中的27種無機(jī)元素的種類、含量及所占比例進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，并采用了主成分分析法(PCA)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步探索。結(jié)果顯示所建立的測定方法檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.018-2.386μg/mL和0.060-7.953μg/mL。精密度和重復(fù)性的結(jié)果范圍分別為0.03％-2.91％和0.69％-2.

8、91％，樣品在一天內(nèi)的穩(wěn)定性范圍為0.13％-2.83％。加樣回收率的結(jié)果的范圍為96.17％-103.30％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)范圍為1.01％-3.30％。用所建立的方法對(duì)裸體方格星蟲樣品中的分析結(jié)果顯示各樣品總含量范圍為149.01-330.55μg/g，其中采自福建廈門的裸體方格星蟲外壁+內(nèi)臟樣品(S4)總含量最低，采自海南三亞的裸體方格星蟲體腔液樣品(S12)總含量最高;每個(gè)產(chǎn)地的裸體方格星蟲的體腔液的總含量均高于外壁+

9、內(nèi)臟的總含量;Na、K、Ca、Mg4種常量元素，總量范圍為13.14-133.24μg/g。
　　三、星蟲激酶提取分離純化、酶學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)外溶栓活性及機(jī)理研究
　?。ㄒ唬┬窍x激酶提取分離純化研究
　　采用纖溶活性跟蹤的方法從裸體方格星蟲中獲取一種具有溶栓作用的活性蛋白酶——星蟲激酶(SK)。取新鮮裸體方格星蟲，洗凈解剖后以PBS緩沖液為提取液經(jīng)兩次勻漿(1000r/min，30s)-凍融（20℃，12h冷凍，4℃解凍）

10、-離心(5000 r/min，10 min，4℃)步驟后得到SK粗水提物。以30％-60％硫酸銨沉淀區(qū)間將SK粗水提物進(jìn)行粗分離，再將經(jīng)3500 D透析除鹽除雜后的SK粗蛋白分別經(jīng)Phenyl Sepharose High Performance疏水作用層析、Q Sepharose High Performance陰離子交換層析和Superdex prep grade G-75凝膠過濾層析結(jié)合3500 D透析或3000 D超濾等多步精制

11、后得到SK。采用Native-PAGE和SDS-PAGE相結(jié)合電泳方法以及凝膠過濾色譜法對(duì)SK進(jìn)行純度鑒定;采用基質(zhì)輔助激光解吸附聯(lián)合飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)對(duì)SK進(jìn)行分子量測定;采用經(jīng)典的Edman降解法對(duì)SK進(jìn)行N端序列測定。結(jié)果表明得到的SK的純度分別達(dá)到了電泳純和色譜純，分子量為28003.67 D，N端序列為PFPVPDPFVWDTSFQ。
　?。ǘ┬窍x激酶酶學(xué)性質(zhì)研究
　　為探究SK的酶學(xué)性質(zhì)，采用

12、纖維蛋白平板法分別測定SK經(jīng)不同溫度條件(10、20、30、40、50和60℃)作用，經(jīng)不同pH緩沖液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)作用，與不同金屬離子作用和不同抑制劑作用后的殘余酶活。結(jié)果表明對(duì)SK的酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明SK在經(jīng)30-40℃區(qū)間溫度作用后活性最大，60℃作用后基本失活;在pH8-9的范圍內(nèi)活性最大，pH=11時(shí)基本失活;各金屬離子對(duì)SK的作用均不顯著，其中Fe2+與SK作

13、用最強(qiáng)，Na+與SK作用最弱;與SK作用的抑制劑中PMSF和Aprotinin與SK作用后，SK活性顯著下降，其余三種均無顯著作用，表明SK是一種絲氫酸蛋白酶。
　?。ㄈ┬窍x激酶對(duì)纖維蛋白及纖維蛋白原的作用
　　采用纖維蛋白平板法研究設(shè)定的5個(gè)濃度的SK對(duì)纖維蛋白作用量效關(guān)系，以尿激酶為對(duì)照，進(jìn)一步探究SK對(duì)纖維蛋白的作用;并采用SDS-PAGE法探究SK對(duì)纖維蛋白原的作用機(jī)制。結(jié)果表明一定劑量范圍內(nèi)，SK溶解纖維蛋白平板

14、所形成的溶圈大小與其劑量存在一定的量效關(guān)系;在富含纖溶酶的未經(jīng)任何處理的纖維平板上，SK可以通過激活纖溶酶原作用纖維蛋白，在不含纖溶酶的經(jīng)85℃加熱纖維平板上，SK可以直接作用于纖維蛋白;對(duì)與SK分別經(jīng)5、10和30min以及1、2、4、6、8和16h降解反應(yīng)后的纖維蛋白原進(jìn)行凝膠電泳分析后發(fā)現(xiàn)SK通過依次對(duì)纖維蛋白原的α鏈、β鏈和γ鏈進(jìn)行降解而對(duì)其起作用的;SK不僅可以直接作用纖維蛋白，還可以通過激活纖溶酶原間接作用纖維蛋白。

15、　?。ㄋ模┬窍x激酶對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓形成的作用
　　采用FeCl3刺激誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓模型來探究SK對(duì)體內(nèi)血栓形成的作用，通過對(duì)動(dòng)脈血栓質(zhì)量的測定、HE染色動(dòng)脈血栓組織形態(tài)學(xué)的觀察以及包括凝血四項(xiàng)(APTT、TT、PT和FIB)、血小板最大聚集率(ADP％)以及TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2在內(nèi)的血液指標(biāo)的變化進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明一定劑量范圍內(nèi)，與模型組相比，SK對(duì)大

16、鼠動(dòng)脈血栓的形成具有顯著抑制作用，并能顯著改善血管組織形態(tài)，對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠的凝血四項(xiàng)（APTT、PT、TT和FIB）、血小板最大聚集率(ADP％)、TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2也均有顯著改善，并且隨劑量遞增，改善作用增強(qiáng)。
　　（五）基于代謝組學(xué)的星蟲激酶對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓形成的作用機(jī)理研究
　　本研究中采用UHPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)和代謝組學(xué)研

17、究方法對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠在星蟲激酶干預(yù)治療下血栓形成過程中大鼠尿液和血漿的代謝組變化進(jìn)行了研究，從血栓形成過程中內(nèi)源性物質(zhì)多元變化，特征標(biāo)志物上調(diào)與下調(diào)以及相關(guān)代謝通路構(gòu)建多角度探討和推測星蟲激酶對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓形成的作用機(jī)制。通過主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)對(duì)假手術(shù)組、動(dòng)脈血栓模型組以及星蟲激酶給藥組的尿液和血漿樣品進(jìn)行多元分類分析，結(jié)果顯示假手術(shù)組、模型組與星蟲激酶給藥組均