UGT酶與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在田薊苷與刺槐素的腸道循環(huán)處置中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　本文主要考察黃酮苷類物質(zhì)田薊苷與其苷元刺槐素的體外Ⅱ相代謝特征。采用Caco-2細(xì)胞模型，研究參與三個(gè)循環(huán)的外排蛋白，以及黃酮苷類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方式。同時(shí)以其為模型藥物，采用大鼠在體腸灌流模型，考察肝腸循環(huán)、腸腸循環(huán)與局部循環(huán)在體內(nèi)能否同時(shí)調(diào)控黃酮類化合物的處置過程。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.田薊苷與刺槐素UGT酶的代謝機(jī)理研究
　　采用人肝微粒體、人腸微粒體以及人源化UGT同工酶對(duì)田薊苷與刺槐素進(jìn)行

2、體外葡萄糖醛酸化孵育，研究田薊苷與刺槐素的葡萄糖醛酸化代謝特征。以高分辨質(zhì)譜(Q-TOF)鑒定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，初步確認(rèn)參與主要代謝的UGT酶亞型。考察主要UGT亞型、人肝微粒體、人腸微粒體的酶代動(dòng)力學(xué)以及種屬性別差異。
　　2.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)田薊苷與刺槐素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制研究
　　以Caco-2細(xì)胞裂解液(Caco-2 cell lysate)對(duì)田薊苷與刺槐素進(jìn)行酶代動(dòng)力學(xué)考察。采用Caco-2細(xì)胞模型，研究田薊苷與刺槐素的轉(zhuǎn)運(yùn)特

3、征。研究MRPs，BCRP對(duì)刺槐素代謝產(chǎn)物的外排作用以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)田薊苷的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。
　　3.腸道循環(huán)對(duì)田薊苷與刺槐素的處置機(jī)制研究
　　采用大鼠在體腸灌流模型以及一系列水解實(shí)驗(yàn)，研究田薊苷在大鼠腸道的吸收與代謝特征。共同灌流β-gus酶抑制劑、乳糖根皮苷水解酶(lactase phlorizinhydrolase，LPH)抑制劑，考察黃酮苷類物質(zhì)田薊苷的水解、吸收、代謝與外排是否受影響，研究田薊苷與刺槐素能否在體內(nèi)同時(shí)

4、參與肝腸循環(huán)、腸腸循環(huán)以及局部循環(huán)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.田薊苷與刺槐素的UGT代謝機(jī)理研究
　　經(jīng)Ⅱ相代謝體系孵育后，代謝產(chǎn)物所出現(xiàn)的準(zhǔn)分子離子峰與碎片離子峰均符合連上一分子葡萄糖醛酸的結(jié)構(gòu)，可判定為田薊苷與刺槐素的葡萄糖醛酸苷。表明田薊苷與刺槐素在體外葡萄糖醛酸化代謝體系中分別產(chǎn)生了單葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。
　　我們選用12種重組人源化UGT亞酶進(jìn)行體外孵育，發(fā)現(xiàn)以UGT1A8進(jìn)行孵育時(shí)，田薊苷與刺槐素的葡

5、萄糖醛酸苷的生成量最大，表明UGT1A8是主要負(fù)責(zé)田薊苷與刺槐素代謝的UGT亞型。隨后，以UGT1A8、人肝微粒體與人腸微粒體對(duì)其進(jìn)行酶代動(dòng)力學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)田薊苷的酶代動(dòng)力學(xué)符合米氏方程酶動(dòng)學(xué)模型(Michaelis-Menten)，田薊苷的清除率在UGT1A8中最高，人腸微粒體次之，人肝微粒體再次之。而刺槐素的酶代動(dòng)力學(xué)符合底物抑制酶動(dòng)學(xué)模型(substrate inhibition)，刺槐素的清除率在人肝微粒體中最高，UGT1A8次之

6、，人腸微粒體再次之。
　　在種屬性別代謝差異研究中，田薊苷與刺槐素在雌性種屬的代謝基本高于雄性種屬。在雄性肝微粒體中，田薊苷與刺槐素在人體的代謝速率與狗的代謝速率最接近;在雌性肝微粒體中，田薊苷在人體的代謝速率與豚鼠和狗的最接近。刺槐素在人體的代謝速率與小鼠和狗的最接近。選用大鼠、小鼠的腸道微粒體對(duì)田薊苷與刺槐素的代謝速率進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌性種屬的代謝速率略高于雄性種屬速率，大鼠的代謝速率普遍高于小鼠。
　　2.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)

7、田薊苷與刺槐素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制研究
　　采用Caco-2 cell lysate對(duì)田薊苷與刺槐素進(jìn)行酶代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)田薊苷經(jīng)Caco-2 cell lysate孵育后，檢測(cè)不到其葡萄糖醛酸苷。刺槐素在Caco-2 celllysate中可生成2個(gè)葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，且代謝速率較快。
　　在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，刺槐素在Caco-2細(xì)胞中可迅速代謝為葡萄糖醛酸苷并且被外排，加入A面外排蛋白MRP2和B面外排蛋白MRP

8、3的抑制劑以及A面外排蛋白BCRP的抑制劑后，刺槐素葡萄糖醛酸苷在Caco-2細(xì)胞上的外排率、轉(zhuǎn)運(yùn)量、Fmet值顯著下降，細(xì)胞內(nèi)刺槐素葡萄糖醛酸苷含量顯著增高，提示著MRP2，MRP3與BCRP很可能是負(fù)責(zé)刺槐素葡萄糖醛酸苷外排的外排蛋白。
　　另外，田薊苷能以原型的形式進(jìn)入Caco-2細(xì)胞，但細(xì)胞內(nèi)含量?jī)H為給藥量10％左右。加入A面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT1的抑制劑和B面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT2抑制劑，田薊苷的轉(zhuǎn)運(yùn)量和細(xì)胞內(nèi)含量均無顯

9、著變化。表明田薊苷可以原型的形式進(jìn)入細(xì)胞，但SGLT1和GLUT2很可能不是負(fù)責(zé)其轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。
　　3.腸道循環(huán)對(duì)田薊苷與刺槐素的處置機(jī)制研究
　　在大鼠在體腸灌流模型中灌流田薊苷單體，在灌流液中，除了田薊苷原型外，還存在苷元刺槐素以及大量刺槐素的葡萄糖醛酸苷。在膽汁中，還存在田薊苷的葡萄糖醛酸苷。田薊苷的吸收率與刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率符合十二指腸、空腸、回腸以及結(jié)腸逐漸下降的趨勢(shì)。田薊苷在十二指腸、空腸的吸收率

10、50％左右，而結(jié)腸的吸收率僅為15％左右。刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率在十二指腸約20％，在空腸幾乎沒有外排。
　　共同灌流田薊苷與20、40與80 mM LPH酶抑制劑葡萄糖酸內(nèi)酯后，灌流液中田薊苷的吸收率與刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率顯著下降，膽汁中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率也顯著下降，提示著LPH在水解田薊苷的過程中發(fā)揮著顯著作用，可將田薊苷水解成刺槐素，再參與腸道循環(huán)。
　　灌流液與膽汁樣品中加入來自大腸桿菌的β-gus

11、后，刺槐素葡萄糖醛酸苷與田薊苷葡萄糖醛酸苷明顯減少，藥物原型刺槐素與田薊苷的明顯增加，表明兩者的葡萄糖醛酸苷均可被細(xì)菌的β-gus水解成藥物原型。提示著膽汁或腸腔中的刺槐素葡萄糖醛酸苷可被β-gus水解成苷元，苷元被腸道重吸收，再被UGT代謝成刺槐素葡萄糖醛苷，隨后經(jīng)肝臟從膽汁外排，流入腸道，從而形成肝腸循環(huán)。
　　水解實(shí)驗(yàn)中已證明腸腔中的葡萄糖醛酸苷可被β-gus水解成藥物原型。當(dāng)灌流田薊苷與β-gus抑制劑葡萄糖二酸單內(nèi)酯(S

12、CL)后，結(jié)腸中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率均顯著下降。證明了當(dāng)β-gus酶受抑制后，刺槐素葡萄糖醛酸苷水解生成的刺槐素減少，刺槐素進(jìn)入細(xì)胞、發(fā)生代謝以及外排的葡萄糖醛酸苷也會(huì)減少，因此刺槐素葡萄糖醛酸苷在結(jié)腸的外排率顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腸腔中的刺槐素葡萄糖醛酸苷被來源于細(xì)菌的β-gus水解成刺槐素，刺槐素在結(jié)腸段被重吸收，形成腸腸循環(huán)。
　　以空白灌流液孵育刺槐素葡萄糖醛酸苷，刺槐素葡萄糖醛酸苷可在小腸空白灌流液中被大量水解為刺

13、槐素，且水解速率高于結(jié)腸段。加入β-gus抑制劑SCL后，水解得到明顯抑制。但將灌流液過濾除菌后，水解速率無顯著下降，提示著細(xì)菌分泌的β-gus并不是β-Gus的唯一來源，β-gus很可能來源于小腸腸道黏膜細(xì)胞分泌的β-gus。灌流田薊苷與β-gus抑制劑SCL后，十二指腸、空腸、回腸中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率均顯著下降。結(jié)果表明腸腔中的刺槐素的葡萄糖醛酸苷可被來源于小腸黏膜細(xì)胞的β-gus水解成苷元刺槐素，刺槐素被小腸段重新吸收，形

14、成局部循環(huán)。
　　四、結(jié)論
　　1.黃酮苷類物質(zhì)田薊苷與其苷元刺槐素在體外可發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)。UGT1A8是參與兩者葡萄糖醛酸化的主要UGT亞型。刺槐素比田薊苷在腸道以及肝臟更容易發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)。田薊苷與刺槐素存在明顯的種屬及性別差異。對(duì)于這兩種化合物來說，狗的代謝速率與人最接近，雌性種屬的代謝速率高于雄性種屬。
　　2.刺槐素在Caco-2細(xì)胞中可發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝與外排，外排蛋白MRP2、MRP3與LT

15、C4很可能參與刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排。田薊苷可以原型的形式進(jìn)入Caco-2細(xì)胞中，但不能發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)或反應(yīng)速率極低。田薊苷可能不是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT1和GLUT2的底物，仍需更多的實(shí)驗(yàn)探索其進(jìn)入細(xì)胞的途徑。
　　3.田薊苷和刺槐素在大鼠體內(nèi)也可發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝與外排，在腸道和肝臟可經(jīng)歷肝腸循環(huán)、腸腸循環(huán)以及局部循環(huán)。首先，田薊苷被LPH酶水解生成苷元刺槐素。被水解后，刺槐素被小腸上皮細(xì)胞快速吸收并擴(kuò)散入血，到達(dá)肝臟

16、。刺槐素在腸道細(xì)胞與肝臟細(xì)胞中均可被快速代謝生成葡萄糖醛酸苷，其極性與分子量較大，在肝臟細(xì)胞被代謝生成的葡萄糖醛酸苷被外排到膽汁中，流入腸腔，隨后，葡萄糖醛酸苷可被結(jié)腸中來源于細(xì)菌的β-gus水解生成苷元刺槐素，被結(jié)腸段重新吸收（肝腸循環(huán)）。另外，在腸黏膜細(xì)胞被代謝生成的葡萄糖醛酸苷也被外排到腸腔中，其也可被結(jié)腸中來源于細(xì)菌的β-gus和小腸中游離的β-gus水解生成刺槐素，刺槐素可在結(jié)腸（腸腸循環(huán)）或小腸（局部循環(huán)）中被重新吸收，完成