Cu2+在厭氧條件下對鐵硫蛋白的影響.pdf

1、目的:
　　通過微生物遺傳學、生物化學與分子生物學等分析手段系統的研究，能夠闡述Cu2+在厭氧條件下對鐵硫簇組裝的影響以及Cu2+對大腸桿菌毒性比在有氧條件下增大的機制，從而為鐵硫簇組裝機制和銅的殺菌機制研究奠定了重要的理論基礎。
　　方法:
　　1. 厭氧條件下銅離子毒性增大的驗證及銅離子實驗濃度的選定。
　　1)Cu2+實驗濃度的選定
　　配制不同Cu2+濃度的LB平板，在平板上滴加OD600=0.05

2、的菌液，分別放在有氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)24小時，觀察菌落狀態(tài)及大小，初步驗證厭氧條件下Cu2+毒性的增加及得到適合實驗的Cu2+濃度。
　　2)生長曲線的繪制
　　在有氧和厭氧條件下通過終點法測定大腸桿菌在不同Cu2+濃度LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線，將有氧和厭氧條件下Cu2+對細菌生長的影響量化，并得到實驗Cu2+濃度。
　　2. 厭氧條件下Cu2+對多種鐵硫簇組裝影響的的驗證。
　　2.1 [4Fe-4S]

3、蛋白IlvD的表達，純化及活性測定
　　1)設置四種實驗環(huán)境，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μM Cu2+。在四種條件下進行IlvD的表達。蛋白質經Ni柱親和純化。純化后的蛋白用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描分析，并進行蛋白濃度測定和SDS-PAGE電泳分析。
　　2)蛋白鐵、硫、銅含量的測定
　　A.采用菲咯嗪法測定蛋白中的鐵含量:在L-cysteine的作用下，蛋白

4、樣品中的鐵釋放出來并與菲咯嗪(Ferrozine)結合形成Fe-Ferrozine絡合物，在564 nm處具有特征性吸收峰，其消光系數為27.9 mM-1cm-1，利用公式CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9(單位:μM)求得鐵含量。
　　B.采用DPD法測定蛋白中的硫含量:硫化物與FeCl3相互作用，DPD(Ndiethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669 nm處形成特征性吸收峰，利

5、用公式及硫的消光系數即可算得蛋白中的硫含量。由于硫的消光系數不穩(wěn)定，以Nth（一種穩(wěn)定的[4Fe-4S]蛋白）為陽性對照，用Nth計算硫的消光系數。根據公式計算硫含量: CS=(OD669-OD800)*1000/S消光系數(單位:μM)S消光系數=(OD669-OD800)*1000/Nth CSNth CS=Nth CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9
　　C.銅含量測定參考Tutem的方法進行改進，160μ

6、L蛋白與10μL5 mMneocuproine（溶解在50％無水乙醇中）、20μL20％ SDS和10μL5 mM維生素C混合，室溫孵育30 min，離心，取上清測定。其在450 nm處具有特征性吸收峰，其消光系數為8.1 mM-1cm-1，利用公式CCu=(OD450-OD700)*1000/8.1（單位:μM）求得銅含量。
　　3)IlvD（二羥酸脫水酶）活性測定。
　　原理是IlvD催化底物D，L-2，3-二羥基-異戊

7、酸產生具有240 nm吸收峰的產物(酮酸，消光系數為0.19 mM-1cm-1)，利用分光光度計檢測240 nm來反映產物的生成量，從而計算IlvD酶的活性。具體方法是取純化后的IlvD10-20μL迅速加入含有50 mM Tris(pH8.0)、10 mM MgCl2和10mM底物的反應液中，37℃反應并監(jiān)測240 nm的吸光度2 min，通過計算2 min內新生產物的生成量來得到IlvD的酶活力。
　　2.2 [4Fe-4S]

8、蛋白Nth和[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW四種條件下的表達純化及全波長掃描分析，并進行SDS-PAGE電泳分析和鐵、硫、銅含量的測定。
　　3. 厭氧條件下Cu2+對鐵硫簇組裝影響方式的研究。
　　在鐵硫蛋白表達前加Cu2+處理，鐵硫蛋白表達后洗去誘導劑然后再加銅處理。分別純化蛋白，純化后的蛋白進行全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵，硫，銅含量的測定。
　　4. 厭氧條件下Cu2+對在iscA突變菌

9、和iscU突變菌中表達的Nth的影響。在iscA突變菌，iscU突變菌中表達純化Nth蛋白，分四個實驗條件，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μM Cu2+。表達純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析以及鐵、硫、銅含量的測定。
　　5. 厭氧條件下Cu2+對IscA蛋白，IscU蛋白和IscS蛋白的影響。
　　5.1 IscA在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加

10、Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表達純化，全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵、硫、銅含量的測定。
　　5.2 IscU在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表達純化，全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測定。
　　5.3 IscS在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表

11、達純化，全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及IscS活性測定。將純化的IscS與L-cysteine、DTT在37℃條件下進行孵育， IscS可催化底物L-cysteine脫硫，在DTT存在的條件下形成H2S，H2S與FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669 nm處形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系數即可算得蛋白中的硫含量，硫含量的多少可以直接反映IscS活性

12、的大小。
　　6. 厭氧條件下IscA蛋白和IscU蛋白體內銅離子梯度結合研究。
　　在厭氧條件下設置不同濃度的銅離子梯度(0μM，50μM，100μM，200μM)，進行IscA和IscU蛋白的表達和純化，純化后的蛋白進行全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵，硫，銅含量的測定。
　　7. 厭氧條件下IscA蛋白和IscU蛋白體外銅離子梯度結合研究。
　　7.1 在M9培養(yǎng)基中表達純化IscA，制備ap

13、o-IscA蛋白。在體外條件下設置銅離子梯度(0μM，25μM，50μM，100μM，200μM，300μM)，加入25μMBSA，25μM apo-IscA，2 mM DTT分別在有氧和厭氧環(huán)境下處理30min，并進行重新純化，純化后的蛋白進行全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測定。
　　7.2 在LB培養(yǎng)基中表達純化IscU，制備apo-IscU蛋白。在體外條件下設置不同濃度的銅離子梯度(0μM，100μM，

14、200μM，400μM，600μM，800μM)，加入25μM BSA，25μM apo-IscU，2 mM DTT分別在有氧和厭氧環(huán)境下處理30 min，重新純化，純化后的蛋白進行全波長掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測定。
　　結果:
　　1. 平板37℃生長24h取出后，在有氧狀態(tài)下，觀察到野生MC4100在2 mM銅離子濃度下，菌落狀態(tài)仍然正常。在厭氧條件下，200μM銅離子處理后菌落狀態(tài)仍然正常，50

15、0μM處理后菌落若隱若現。通過平板實驗看出厭氧條件下相同濃度的Cu2+對細菌生長產生了更大的影響。初步選取了200μM Cu2+濃度為實驗濃度。在進一步的生長曲線實驗發(fā)現，200μM Cu2+濃度在厭氧條件下對細菌生長影響不大，抑制了僅有20％。
　　2. 純化后的[4Fe-4S]蛋白Nth（核酸內切酶Ⅲ）和IlvD（二羥酸脫水酶），[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW進行全波長掃描結果發(fā)現，同樣加200μM Cu2+，LB中誘

16、導表達的[4Fe-4S]蛋白Nth和IlvD在厭氧條件下其鐵硫簇的吸收峰(419nm)明顯下降，對純化后蛋白鐵、硫含量測定及對IlvD進一步活性測驗也顯示同樣的結果。而[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW卻沒有明顯下降。純化后蛋白鐵、硫含量測定也沒有發(fā)生明顯改變，初步得出結論:厭氧條件下200μM Cu2+對[4Fe-4S]蛋白毒性顯著增強。
　　3. 在四個實驗條件下分別從iscA突變菌，iscU突變菌和野生MC4100中純化

17、出Nth蛋白，通過全波長掃描發(fā)現同樣加200μM Cu2+在iscA突變菌和iscU突變菌中表達純化的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419 nm)幾乎消失，對蛋白的鐵、硫含量的測定也證實了該結果。
　　4. 在先加銅處理后誘導表達Nth蛋白及先誘導表達Nth蛋白后再加銅處理的實驗中，通過全波長掃描發(fā)現，先加銅后誘導表達的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419nm)明顯下降，而誘導表達后再加銅的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419nm)沒有

18、明顯改變。說明了厭氧條件下Cu2+對[4Fe-4S]產生的毒性是影響了鐵硫蛋白合成的通路，而不是對已經合成的[4Fe-4S]蛋白產生毒性。
　　5. 鐵硫簇組裝通路中的IscA，IscU和IscS（半胱氨酸脫硫酶）蛋白的全波長掃描發(fā)現IscA，IscU蛋白在厭氧條件下加200μM Cu2+，其Cu2+結合峰(258nm)明顯升高，通過對蛋白銅含量的測定也顯示同樣結果。而IscS沒有變化，其活性測定也顯示沒有影響。
　　6.

19、厭氧條件下，在LB中添加不同濃度的銅離子（0μM，50μM，100μM，200μM）表達IscA和IscU蛋白并純化，對純化后的蛋白進行全波長掃描分析其Cu2+結合峰(258 nm)逐漸升高，銅結合量也是逐漸升高。
　　7. apo-IscA和apo-IscU蛋白在體外銅離子梯度處理后，重新純化，重新純化后的IscA和IscU蛋白經過Cu含量測定，有氧條件下，顯示IscA在加入200μM銅離子后曲線漸平，說明其銅離子結合量趨于飽和

20、，每個IscA結合約2個銅。厭氧條件下在加入50μM銅離子后曲線就開始平緩，銅離子結合量趨于飽和，每個IscA結合約2個銅。IscU有氧條件下在加入400μM銅離子后曲線漸平，說明其銅離子結合量趨于飽和接近于每個蛋白結合1個銅。厭氧條件下在加入800μM銅離子后曲線仍然上升。
　　結論:
　　1. MC4100和Ecoii CusA-CopA-CueO-/MC4100在厭氧條件下對銅離子的敏感度都比有氧條件下對銅離子的敏感高

21、。其中MC4100有氧條件下Cu2+濃度在2 mM時菌落仍然正常，但是在厭氧條件下500μM時細菌生長就已經完全抑制。
　　2. 厭氧條件下銅離子對鐵硫簇的影響只體現在[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而不影響[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝。
　　3. 厭氧條件下銅能夠有效的抑制LB培養(yǎng)基生長的E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，但對已經組裝好的鐵硫簇沒有明顯的影響。
　　4. 厭氧條件下，在野生菌MC4100和is