基于文獻(xiàn)挖掘和生物信息學(xué)技術(shù)篩選膠原水凝膠誘導(dǎo)成軟骨關(guān)鍵基因.pdf

1、目的：篩選分析材料誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨的關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步研究這些基因在材料誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨方向分化中涉及的相關(guān)信號(hào)通路，用以研究膠原水凝膠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成軟骨的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：本文首先運(yùn)用文獻(xiàn)挖掘和生物信息學(xué)技術(shù)，綜述了近10年誘導(dǎo)軟骨形成的文獻(xiàn)，同時(shí)以GENEVESTIGATOR軟件篩選材料誘導(dǎo)成軟骨的相關(guān)基因；然后，對(duì)篩選出來(lái)的基因進(jìn)行通路富集和共性通路分析，根據(jù)分析的綜合評(píng)分和研究相關(guān)性，選取ECM

2、-受體互作（ECM-receptor interaction）通路和TGF-β信號(hào)（TGF-beta signaling pathway）通路中的8個(gè)基因做為可能的材料誘導(dǎo)成軟骨的關(guān)鍵基因（ITGB1、TNC、COMP、COL5A1、COL6A2、SMAD6、FST和ID3）；最后，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行基因/蛋白互作分析。進(jìn)一步的，本文通過(guò)GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)分析關(guān)鍵基因的差異性表達(dá)情況，已公布的實(shí)驗(yàn)芯片數(shù)據(jù)顯示部分基因有一定的基因差異性表達(dá)

3、，但是，已公布的數(shù)據(jù)中材料誘導(dǎo)成軟骨的數(shù)據(jù)較少，且實(shí)驗(yàn)周期短。因此，我們提出實(shí)驗(yàn)假設(shè)，材料能激活細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的受體，進(jìn)而激活ECM-受體相關(guān)通路基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間的相互作用并刺激分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子，營(yíng)造誘導(dǎo)分化成軟骨的微環(huán)境。為了進(jìn)一步研究膠原水凝膠誘導(dǎo)成軟骨的分子機(jī)理，本文以BMSCs-膠原水凝膠構(gòu)建體外軟骨誘導(dǎo)模型對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行探索驗(yàn)證。首先分離和培養(yǎng)擴(kuò)增SD大鼠BMSCs，并復(fù)合膠原水凝膠構(gòu)建體外軟

4、骨模型，實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（B）、生長(zhǎng)因子組（BT）、材料誘導(dǎo)組（BC）和陽(yáng)性對(duì)照組（BCT）。然后，各組分別培養(yǎng)7天、14天和21天，并按各時(shí)間段取材。最后，檢測(cè)樣品如下各指標(biāo)：（1）細(xì)胞增殖檢測(cè)；（2）細(xì)胞形貌觀察；（3）細(xì)胞存活情況觀察；（4）鬼筆環(huán)肽/hoechst33258熒光染色觀察纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)在細(xì)胞中的分布和動(dòng)態(tài)變化情況；（5）番紅O染色、Masson染色和DMMB試劑檢測(cè)細(xì)胞分泌軟骨特異基質(zhì)；（6）免

5、疫組織化學(xué)檢測(cè)；（7）qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況；（8）免疫印跡Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過(guò)體外構(gòu)建膠原水凝膠誘導(dǎo)軟骨模型，考察膠原水凝膠誘導(dǎo)BMSCs成軟骨過(guò)程中的關(guān)鍵基因和相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)果如下：（1）BMSCs在膠原水凝膠表面體外單層擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞增殖檢測(cè)和細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，膠原水凝膠具有良好的生物相容性，具有促進(jìn)BMSCs在膠原水凝膠表面錨定和團(tuán)聚生長(zhǎng)的作用；

6、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明膠原水凝膠表面涂層前期可誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力逐漸下降，在21天時(shí)，初步形成的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化的特性，表現(xiàn)為軟骨特征基因COLII、ACAN和COMP等表達(dá)顯著下降，而相反的，COLI的表達(dá)上調(diào)。（2）BMSCs復(fù)合膠原水凝膠構(gòu)建體外軟骨誘導(dǎo)模型，結(jié)果顯示，BC組誘導(dǎo)成軟骨的效果與BCT組相近，明顯優(yōu)于BT組和B組，空白對(duì)照B組的效果最差。BC組的組織學(xué)檢測(cè)（H

7、E染色、番紅O染色和Masson染色）和生化檢測(cè)（DNA含量和GAG含量檢測(cè)）結(jié)果都說(shuō)明膠原水凝膠能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及qRT-PCR檢測(cè)分析得到，BC組的軟骨分化特征基因（COLII、ACAN、COMP和SOX9）的表達(dá)均隨時(shí)間呈增高趨勢(shì)，與BCT組相近，明顯高于B組，且優(yōu)于BT組，這說(shuō)明膠原水凝膠已經(jīng)誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化并分泌合成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分。此外，BC組和BCT組的COLI的表達(dá)逐漸減少，說(shuō)明

8、膠原水凝膠在誘導(dǎo)成軟骨的同時(shí)能夠維持軟骨分化的微環(huán)境，防止軟骨的去分化。與Western Blot結(jié)果一致，BC組中ITGB1、TNC、SMAD6、SMAD2和SMAD3等蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與BCT組基本一致，優(yōu)于B組和BT組。
　　結(jié)論：在不添加生長(zhǎng)因子的條件下，BMSCs包埋于膠原水凝膠中體外誘導(dǎo)21天，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，向軟骨方向分化及有特定軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成。膠原水凝膠誘導(dǎo)成軟骨的分子機(jī)制可能是，膠原水凝膠可體外激活包埋在