利用通用型聚二甲基硅氧烷微孔陣列微反應器研究空間堆疊因素對人脂肪干細胞增殖、凋亡、分化的影響.pdf

1、將種子細胞與多孔支架（人工合成或天然）混合后培養(yǎng)是組織工程體外實驗的主要模式，再配合特定培養(yǎng)條件使種子細胞向特定方向分化、增殖，可以滿足定向組織構建的需求。脂肪干細胞具有取材難度低、增殖活性高、分化方向多、表型表達穩(wěn)定等特性，是目前組織工程研究比較理想的種子細胞。
　　現(xiàn)階段，越來越多的學者認識到支架內(nèi)部空間立體因素對種子細胞增殖、分化存在影響。但由于常用的支架材料大多不透明，如要觀察所種植細胞的行為大多需要通過破壞細胞所處微環(huán)境

2、方能實現(xiàn)。如果能夠在保持細胞及周圍微環(huán)境相對穩(wěn)定的情況下進行無干擾的觀察、檢測，將對解釋空間立體因素作用于細胞的機制提供巨大的幫助。
　　隨著微尺度技術(Micro-scale technologies)的發(fā)展，研究者可以設計、制作微米級甚至納米級細胞培養(yǎng)平臺。其中，微孔陣列(Microwells)實驗平臺因其具有加工難度低、生物親和度高、通用性強、設備需求度低等優(yōu)點，在組織工程領域已獲得越來越多的關注。利用這一平臺可以實現(xiàn)對所種

3、植細胞幾乎無干擾的觀察，為高效率研究物理、空間因素對細胞增殖、分化的影響提供了契機。
　　目的：利用高精度微尺度技術制作出不同孔徑的微米級聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔陣列，再將人脂肪干細胞以一定濃度接種于其中，使細胞在不同直徑微孔內(nèi)呈現(xiàn)多種層疊狀態(tài)（單層、多層）。通過對不同層疊狀態(tài)下細胞的增殖、凋亡、分化等行為進行檢測，一方面驗證此實驗平臺的安全性，另一方面在保持細胞外微環(huán)境不被破壞的前提下對細胞的生物學行為進行觀察、分析，著重

4、探討空間立體因素對人脂肪干細胞體外培養(yǎng)中增殖及分化行為的影響。
　　方法：(1)通用型PDMS微孔陣列微反應器的構建:借助高精度微尺度技術在硅晶元表面制作高度為50μm及直徑分別為60μm、80μm、100μm和150μm的微柱狀結構，經(jīng)聚二甲基硅氧烷(PDMS)倒模生成同規(guī)格孔徑的微孔陣列，加裝PDMS環(huán)形外壁后組成微反應器。測量、分析此實驗平臺所生成微孔的誤差率，并測試微反應器的密封性。(2)人脂肪干細胞體外培養(yǎng)的增殖、分化特

5、性及鑒定:對成品人脂肪干細胞進行體外培養(yǎng)鑒定，檢測第1、3、6代細胞活性，觀察其形態(tài)變化、生長趨勢和活細胞比例，并繪制細胞生長曲線、計算群體倍增時間;檢測此三代細胞的表面抗原標記是否存在差異;選取第3代細胞進行成脂、成骨誘導分化，并通過油紅O、茜素紅染色及成脂分化（PPAR-γ、β-Actin和C/EBPα）、成骨分化(OPN、OCN和AKP)特異性標記物進行鑒定，判斷其成脂、成骨分化能力。(3)利用通用型PDMS微孔陣列微反應器研究空

6、間堆疊因素對人脂肪干細胞增殖、凋亡的影響:取第3代人脂肪干細胞配制成3×104/ml、6×104/ml、1×105/ml三種濃度單細胞懸液，分別接種于無微孔PDMS平面微反應器、普通培養(yǎng)皿密閉培養(yǎng)區(qū)及具備直徑60μm、80μm、100μm和150μm微孔的微孔陣列微反應器內(nèi)，選擇種植后24h、72h、120h和168h為采樣點，用光學顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞分布狀況并進行形態(tài)學描述，再用激光掃描共聚焦顯微鏡對經(jīng)熒光染色細胞進行細胞分布、

7、細胞計數(shù)及凋亡計數(shù)檢測，確定能夠最終實現(xiàn)可控堆疊模型（單層組、1-2層組、2-3層組）的脂肪干細胞懸液濃度-微孔孔徑配比。(4)利用通用型PDMS微孔陣列微反應器研究空間堆疊因素對人脂肪干細胞成脂、成骨分化傾向的影響:在前一實驗基礎上選擇具備80μm、100μm和150μm直徑微孔的PDMS微孔陣列微反應器，配制濃度為6×104/ml的脂肪干細胞單細胞懸液接種于微反應器內(nèi)，形成三組具備不同堆疊層數(shù)（單層組、1-2層堆疊組、2-3層堆疊組

8、）的三維培養(yǎng)實驗組，接種后24h開始成脂和成骨誘導，于誘導后14d對微反應器內(nèi)的細胞進行油紅O和茜素紅染色，并于誘導后0d、7d、14d將微反應器內(nèi)的細胞消化后收集，分別對其成脂分化（PPAR-γ、β-Actin和C/EBPα）、成骨分化（OPN、OCN和AKP）特異性標記物進行定量分析，比較各時間點不同堆疊狀態(tài)對脂肪干細胞分化傾向性的影響。
　　結果：(1)實驗一:成功構建高精度通用型PDMS微孔陣列微反應器，各孔徑誤差率＜±0

9、.2％，微反應器外壁與底面黏著良好無滲漏。(2)實驗二:人脂肪干細胞體外培養(yǎng)具有穩(wěn)定且旺盛的生長能力，增殖能力強且穩(wěn)定，第1、3、6代細胞活細胞比例并無顯著性差異(p=0.108)，此三代細胞間群體倍增時間無顯著性差異(p=0.104);細胞表面標記物符合間充質干細胞特征，CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71和CD105呈現(xiàn)高表達，CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56和HLA-DR呈現(xiàn)低表達

10、或無表達，且經(jīng)多次傳代后仍保持比例穩(wěn)定;經(jīng)體外成脂、成骨誘導后，細胞經(jīng)特異性染色鑒定（油紅O、茜素紅）及特異性標記物表達檢測（成脂:PPAR-γ、β-Actin、C/EBPα，成骨:OPN、OCN和AKP），證實其具有分化為脂肪細胞及成骨細胞的能力，且隨培養(yǎng)時間延長表達量顯著增高(p＜0.01)。(3)實驗三:細胞在PDMS平面與普通培養(yǎng)皿表面培養(yǎng)并無明顯差異;利用PDMS微孔陣列可以構建滿足實驗設計需要的細胞堆疊模型，人脂肪干細胞以6

11、×104/ml濃度接種時，可以實現(xiàn)在150μm直徑微孔內(nèi)呈單層平鋪、100μm直徑微孔內(nèi)呈2層堆疊、80μm直徑微孔內(nèi)呈3層堆疊，微孔內(nèi)細胞數(shù)在7d內(nèi)穩(wěn)定無顯著增減;60μm直徑微孔內(nèi)細胞量最少(p＜0.05)，且微孔內(nèi)細胞凋亡比例高于其他各組(p＜0.05);堆疊層數(shù)越高，細胞凋亡比例越高。(4)實驗四:處于不同堆疊狀態(tài)的人脂肪干細胞其分化傾向存在差異，成脂分化傾向以單層組最高、2層堆疊次之、3層堆疊組最低(p＜0.05);成骨分化傾

12、向以2層堆疊最高、3層堆疊次之、單層組最低(p＜0.05);微反應器內(nèi)特異性分化標記物水平升高晚于純平面培養(yǎng)。
　　結論：本研究成功設計并制作出通用型PDMS微孔陣列微反應器，其底板為大量排列整齊、誤差率極小的微米級微孔陣列，配合PDMS彈性外壁形成以微孔陣列區(qū)為中心的微反應環(huán)境。
　　成品人脂肪干細胞具有基本一致的細胞表面標記及免疫特征，不僅具有旺盛、持久的增殖活性，還能保證其細胞表面標記經(jīng)過多代增殖后不發(fā)生顯著改變，更能

13、實現(xiàn)體外人工誘導下的成脂、成骨分化，滿足實驗需求。
　　將此細胞群種植于PDMS微反應器微孔陣列區(qū)內(nèi)，借助微米級平臺的結構穩(wěn)定性，結合對接種密度與微孔設計的調(diào)整，構建了可控的細胞立體空間堆疊模型;同時，由于PDMS材質的高透光性，能夠實現(xiàn)對微孔內(nèi)細胞分布、增殖的無創(chuàng)性觀察;對微孔內(nèi)細胞經(jīng)過成脂、成骨誘導并進行相關分化標記物檢測，明確在不同堆疊狀態(tài)下標記物表達水平。通過本實驗，不僅收集了細胞堆疊平臺所需的基本數(shù)據(jù)（細胞接種濃度、微孔