母親孕期高脂暴露對子代代謝健康的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分母親孕期高甘油三酯血癥通過重編程子代瘦素水平誘發(fā)成年期高血壓
　　目的:證實母親孕晚期高甘油三酯(TG)血癥可增加出生子代成年高血壓的發(fā)生風(fēng)險，探討瘦素(leptin)基因的甲基化改變在其中發(fā)揮的作用。
　　材料和方法:臨床隨訪不同出生體重的個體在學(xué)齡前期、學(xué)齡期和成年期的身高、體重和血壓的變化并留取部分人群血清檢測leptin水平。同時臨床調(diào)查2687例孕婦孕晚期的血脂數(shù)據(jù)和子代出生的基本信息，并留取母親血和臍帶血

2、檢測血脂、脂肪酸以及l(fā)eptin等的水平;高脂喂養(yǎng)建立孕期高脂血癥大鼠模型，留取母親孕期血清檢測血脂水平，證實孕晚期存在高甘油三酯血癥。收集子代大鼠各個年齡段（胎鼠，3周，8周，6月，1年）的淋巴細(xì)胞和/或脂肪組織以及腎臟，分別檢測leptin基因的表達和腎小動脈管壁厚度。用亞硫酸鹽測序方法檢測人臍血和外周血淋巴細(xì)胞leptin基因的表達和甲基化水平。同樣方法檢測胎鼠和3周大鼠的脂肪leptin基因的甲基化以及3周大鼠淋巴細(xì)胞的甲基化變

3、化。利用胎鼠期間分離出來的骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)進行深入的機制探討。MSC在成脂分化過程中加不同濃度的脂肪酸，檢測高濃度的脂肪酸對成脂分化過程中l(wèi)eptin基因表達和甲基化的作用。
　　結(jié)果:出生巨大兒的個體從兒童期一直到成年時期均表現(xiàn)出持續(xù)升高的血清leptin水平，且在成年期血壓明顯高于正常出生體重的成年個體，且30-50歲的高血壓發(fā)生率在巨大兒組明顯升高，盡管兩組之間的體重指數(shù)(BMI)無顯著差異。巨大兒和正常出

4、生體重兩組的母親孕期血脂比較結(jié)果提示巨大兒組母血甘油三酯水平(mTG)顯著高于對照組。因此，我們再根據(jù)臨床調(diào)查的2687例孕晚期母親血TG值計算平均值為3.28mM，然后按照3.28mM把數(shù)據(jù)分為高母親血脂組(mTG≤3.28mM)和低母親血脂組(mTG＞3.28mM)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高mTG組母親出生的子代臍帶血和學(xué)齡前期的外周血血清leptin水平均顯著升高，而且無論是出生時還是學(xué)齡前階段，血清leptin水平與母親血清TG水平呈顯著正相

5、關(guān)。高脂喂養(yǎng)動物出生子代自8周起體重已趨于同齡對照組大鼠，但是血壓顯著高于對照組，1年時出現(xiàn)明顯高血壓，伴有腎小動脈管壁的明顯增厚。高脂母親出生的子代大鼠各個年齡段的血清leptin水平表現(xiàn)為持續(xù)升高，同時各個年齡段的脂肪組織和淋巴細(xì)胞leptin基因均持續(xù)顯著的高表達。高TG母親出生的新生兒和學(xué)齡前兒童的淋巴細(xì)胞leptin基因表達顯著高于對照組，同時伴隨著甲基化水平的顯著降低。與臨床結(jié)果一致，高脂喂養(yǎng)母親子代的胎鼠脂肪、3周齡的皮下

6、脂肪和內(nèi)臟脂肪均出現(xiàn)leptin基因的高表達伴隨著低甲基化狀態(tài)，同時3周齡子代大鼠的淋巴細(xì)胞leptin也呈現(xiàn)高表達和低甲基化。體外MSC誘導(dǎo)分化過程中加高濃度的脂肪酸可增加leptin基因的表達和促進去甲基化酶TET1的高表達，導(dǎo)致leptin基因的低甲基化。
　　結(jié)論:母親孕期高脂暴露可通過修飾leptin基因的甲基化影響其表達從而誘導(dǎo)子代成年高血壓的發(fā)生。
　　第二部分:母親孕期高甘油三酯血癥可通過調(diào)節(jié)leptin介導(dǎo)

7、的膽固醇代謝通路增加子代高膽固醇血癥的風(fēng)險
　　目的:探討母親孕期高甘油三酯血癥導(dǎo)致的持續(xù)升高的leptin水平是否通過調(diào)節(jié)膽固醇分解代謝的關(guān)鍵酶膽固醇7α-羥化酶(CYP7α1)的表達，從而增加子代發(fā)生高膽固醇血癥的風(fēng)險。
　　材料與方法:隨機電話隨訪2006-2007年在我院分娩出生的兒童250例，收集自愿回隨訪門診體檢的49例學(xué)齡前期兒童（3-6歲）的血清檢測血清leptin、血脂四項等水平，同時回顧性調(diào)查其母親孕期的

8、血脂水平和出生相關(guān)資料。利用孕期高脂喂養(yǎng)大鼠模型進一步驗證高脂子代3周齡大小時血清leptin以及血脂水平，同時用化學(xué)發(fā)光法檢測3周齡子代大鼠肝臟組織勻漿上清血脂水平。Real-timePCR和Western分別用于檢測3周子代大鼠肝臟組織膽固醇代謝關(guān)鍵酶的表達。利用體外培養(yǎng)肝細(xì)胞系HepG2進行機制的研究，觀察leptin是否可濃度依賴性的調(diào)節(jié)通路因子LEPR-JAK2-STAT3的表達，同時調(diào)控CYP7α1的表達;siRNA靶向干擾

9、轉(zhuǎn)錄因子后進一步證實leptin刺激后通過STAT3發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;免疫共沉淀(CHIP)試驗證實轉(zhuǎn)錄因子STAT3可結(jié)合到CYP7α1基因啟動子區(qū)域發(fā)揮調(diào)控作用。
　　結(jié)果:高mTG組出生子代兒童血清leptin、膽固醇水平顯著高于mTG組，兒童血清leptin水平與膽固醇水平呈顯著正相關(guān)。高脂喂養(yǎng)大鼠出生的子代3周齡時血清leptin和膽固醇水平也呈現(xiàn)顯著升高，肝臟組織勻漿上清總膽固醇水平在高脂子代組顯著高于正常喂養(yǎng)子代組，同時

10、伴有膽固醇降解關(guān)鍵酶CYP7α1的顯著下調(diào)。體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示:隨著leptin濃度的不斷增加，通路因子LEPR、JAK2、STAT3表達濃度依賴性上調(diào)，而高濃度的leptin可下調(diào)CYP7α1的表達。靶向干擾STAT3后， leptin刺激下CYP7α1表達不再濃度下調(diào)，CHIP試驗結(jié)果進一步提示轉(zhuǎn)錄因子STAT3可結(jié)合CYP7α1基因啟動子區(qū)域發(fā)揮調(diào)控作用。
　　結(jié)論:母親孕期高甘油三酯血癥出生子代兒童期高膽固醇血癥風(fēng)險增加

11、，孕期高脂誘導(dǎo)的子代持續(xù)高leptin水平可通過LEPR-JAK2-STAT3通路調(diào)控膽固醇降解的關(guān)鍵酶CYP7α1基因的表達。
　　第三部分:孕期高脂暴露誘發(fā)的子代脂質(zhì)代謝異常的傳代機制研究
　　目的:探討親代母親孕期高脂飲食是否對子一代(F1)脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響以及這種不良影響是否能通過配子傳至子二代(F2)。
　　材料與方法:建立孕期高脂喂養(yǎng)(HFD)的大鼠模型，觀察出生的F1代在恢復(fù)正常喂養(yǎng)后各年齡段的體重和脂質(zhì)

12、代謝，再用F1代分別與正常異性大鼠交配以及高脂子代組內(nèi)交配，觀察HFD-F1♂以及HFD-F1♀出生的F2代的各年齡段體重以及脂質(zhì)代謝變化。Real-time PCR方法篩查F1代、F2代肝臟和F1精子中脂代謝相關(guān)的印記基因，篩選出母源印記基因Igf2和父源印記基因Igf2r做進一步的機制研究。再用亞硫酸鹽修飾測序方法分別檢測F2成年肝臟中這兩個印記基因的甲基化改變，來探討親代異常官內(nèi)環(huán)境暴露影響子代的脂質(zhì)代謝的傳代機制。
　　結(jié)

13、果:高脂喂養(yǎng)出生的F1代3周內(nèi)體重顯著高于正常對照組，但是8周起兩組之間無顯著差異。HFD-F1在3周時出現(xiàn)明顯的血脂異常，表現(xiàn)為TG，TC，HDL和LDL水平顯著高于對照F1，8周和12周兩組間無明顯差異，但是HFD-F1在6月和1年時出現(xiàn)明顯的TG的升高，1年的時候同時出現(xiàn)LDL的升高和HDL的下降。盡管F1代恢復(fù)正常飲食，且受孕前和孕期均無高脂血癥，但是HFD-F1♂出生的F2代在8周、12周及6月分別表現(xiàn)為血TG水平的顯著升高，

14、且在12周和6月還伴隨著LDL的升高;與此不同的是，HFD-F1♀出生的F2與對照組間差異不明顯。我們分別篩查了F1和F2肝臟中脂代謝相關(guān)的基因基因，發(fā)現(xiàn)母源印記基因Igf2和父源印記基因Igf2r的甲基化持續(xù)的高表達，同時在F1精子和F2胎肝上驗證這兩個基因均呈現(xiàn)高表達。因此我們檢測了F2肝臟中的印記基因Igf2和Igf2r的甲基化改變，結(jié)果提示HFD-F1♂出生的F2成年肝臟的Igf2出現(xiàn)2個位點的低甲基化，Igf2r基因的總甲基化