基于生物組學的羥基磷灰石骨誘導機理研究.pdf

1、目前，骨損傷修復存在的主要困難之一是可用于填充缺損和促進骨生長的生物材料非常有限。羥基磷灰石是構成骨骼的主要無機成分，由于具有良好的生物相容性、骨傳導性和骨誘導性，現(xiàn)已被廣泛應用于人體骨組織修復中。羥基磷灰石的主要制備方法包括化學合成（稱之為合成羥基磷灰石）和從骨骼和牙齒、魚鱗等天然生物體內提取（稱之為天然羥基磷灰石）兩種方式。合成羥基磷灰石是一個化學分子式為Ca10(PO4)6(OH)2的化學計量材料;而天然羥基磷灰石除了羥基磷灰石的

2、成分以外還包含與骨無機成分相似的微量離子，因此具有與骨礦化成分最大的相似性。目前，基于天然與合成羥基磷灰石醫(yī)用生物材料均已被廣泛使用，但對于天然與合成羥基磷灰石的理化性質的對比研究仍然較少，對于兩種材料生物相容性和堿性磷酸酶活性等成骨性能的比較更少，更未見采用蛋白質組學等高通量技術比較和研究其成骨誘導機理的報道。
　　本課題組前期對天然與合成羥基磷灰石進行了制備與表征，然后對天然與合成羥基磷灰石的蛋白吸附特性進行了比較，并進一步通

3、過基因表達譜芯片技術結合生物信息學分析研究了天然羥基磷灰石對小鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響。在前期研究的基礎上，本論文將對天然與合成羥基磷灰石的理化性質、生物學性能、骨修復能力及其分子機理進行系統(tǒng)的比較，然后通過對天然羥基磷灰石作用于細胞后的轉錄組學、蛋白組學和miRNA的聯(lián)合分析，探討天然羥基磷灰石誘導骨髓間充質干細胞成骨分化所介導的生物學通路及通路中miRNA的調節(jié)作用。本論文包括兩個部分的內容，
　　第一部分是天然和合成

4、羥基磷灰石理化性質及生物學性能比較研究，主要內容包括:
　　1)對天然與合成羥基磷灰石粉體和圓盤狀試樣進行了制備與理化性質的表征，結果顯示，與合成HA相比，天然HA中存在特有的碳酸根、磷酸氫根及鎂和鈉元素;并且天然羥基磷灰石具有更大的單晶尺度和更高的結晶度;此外，浸提液中鈣離子的檢測表明天然HA可能具有更高的穩(wěn)定性，而合成HA則具有更高的溶解-沉積特性;鎂離子檢測表明僅在天然HA組出現(xiàn)鎂離子溶出。
　　2)采用貼壁篩選與密度

5、梯度離心分離相結合的方法對小鼠骨髓間充質干細胞進行了分離提取，然后采用流式細胞術進行鑒定了細胞表面標志物和細胞的同質性，結果顯示，第4代間充質干細胞高表達細胞粘附因子CD29和CD44，而低表達淋巴細胞標志物CD14和造血細胞標志物CD34，這表明第4代細胞已經(jīng)得到了純化，所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。
　　3)采用熒光染色和MTT測定方法研究間充質干細胞在天然與合成羥基磷灰石圓盤狀試樣表面的形貌和增殖情況，結果顯示，天然與合成

6、羥基磷灰石表面所培養(yǎng)的細胞形貌相似，與對照組相比材料表面細胞更易呈團聚狀生長且增殖緩慢。
　　4)采用基于iTRAQ標記的二維液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用技術對天然與合成羥基磷灰石表面生長細胞的蛋白質表達情況進行研究，在天然與合成羥基磷灰石組24和72小時共鑒定出可信蛋白質800個;對所選蛋白質的表達情況進行Western blot驗證顯示兩種方法所得結果具有較好的一致性，這表明蛋白質組學數(shù)據(jù)可信。
　　5)對蛋白質數(shù)據(jù)進行生物信息

7、學分析，結果顯示天然與合成羥基磷灰石對細胞主要的GO功能類別影響相似，但在“對無機物質的反應”、“離子跨膜運輸”、“生物礦化”和“血管發(fā)育”等功能中存在一定的差異;此外，兩種材料能夠通過特定生物學通路介導細胞的增殖、形貌和分化功能，并且生物學通路之間能夠通過蛋白質相互作用網(wǎng)絡而相互聯(lián)系。
　　6)對培養(yǎng)于天然與合成羥基磷灰石表面的細胞進行礦化檢測，結果表明兩種材料表面細胞的礦化程度均高于對照組，但天然羥基磷灰石能夠對礦化作用產生更

8、大的促進作用。
　　第二部分是天然羥基磷灰石成骨誘導機理的轉錄組學、蛋白質組學和miRNA聯(lián)合分析，主要內容包括:
　　1)對天然羥基磷灰石對細胞作用的蛋白質組學和基因表達譜芯片數(shù)據(jù)進行比較，結果顯示，兩組數(shù)據(jù)在各時間點的上調表達基因或蛋白質數(shù)量均大于下調表達的基因或蛋白質數(shù)量;對蛋白質組學數(shù)據(jù)進行GO功能分析共篩選到4個與成骨分化相關的節(jié)點，分別為骨骼發(fā)育、細胞分化調控、細胞分化負向調控和細胞分化正向調控。這4個節(jié)點包含在

9、基因表達譜芯片數(shù)據(jù)所涉及的13個與成骨分化相關的節(jié)點中。在這4個節(jié)點中最終篩選得到10個與成骨分化相關的蛋白質。
　　2)對蛋白質組學數(shù)據(jù)與基因表達譜芯片數(shù)據(jù)進行生物學通路聯(lián)合分析，共得到89條mRNA和蛋白質共同參與的生物學通路，其中MAPK信號通路和TGF-β受體信號通路等可能在天然羥基磷灰石所誘導的成骨分化中發(fā)揮重要作用。
　　3)對microRNA在天然羥基磷灰石成骨誘導中的調節(jié)作用進行分析，結果顯示在所檢測的13個

10、microRNA中，有9個microRNA在分化相關通路中發(fā)揮了調控作用，其中miR-26a和miR-26b可能通過調控成脂分化通路從而對細胞的成脂分化產生抑制作用，而miR-222可能通過調控MAPK通路從而在細胞的成骨分化中發(fā)揮重要的促進作用。
　　4)對天然羥基磷灰石的成骨誘導能力進行了檢測，堿性磷酸酶染色實驗顯示培養(yǎng)于天然羥基磷灰石表面的間充質干細胞能夠被誘導成骨分化;成骨分化通路驗證試驗表明，天然羥基磷灰石通過MEK1/