二維和三維培養(yǎng)小鼠ADMSCs成心肌分化的效果比較.pdf

1、背景：
　　心肌細胞的再生能力有限，目前心臟組織工程為心臟疾病后心肌細胞的修復和再生帶來了新的治療策略。在可移植的種子細胞中，脂肪間充質(zhì)干細胞(AdiposeMesenchymal Stem Cells，ADMSCs)因其來源廣泛、取材方便，倫理限制較少，已成為心肌組織工程理想的種子細胞之一。Atelocollagen膠原具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性，可被制成三維立體支架，用作組織填充物和細胞培養(yǎng)支架。目前尚不知道ADM

2、SCs是否可以在Atelocollagen支架上被培養(yǎng)成三維心肌。本研究試圖把誘導心肌化的ADMSCs種植在支架上，體外培養(yǎng)成立體心肌。
　　目的：
　　探討小鼠ADMSCs在二維和三維培養(yǎng)條件下，利用不同誘導方法，評價誘導成心肌分化的效果，以及判斷三維培養(yǎng)后的ADMSCs在心臟內(nèi)的存活情況，為心肌組織工程提供實驗參考。
　　方法：
　　1.取小鼠腹股溝皮下脂肪組織，分離培養(yǎng)ADMSCs，傳至第3代后，用CD29

3、+、CD45-標記，流式細胞儀分選ADMSCs。
　　2.使用成脂、成骨誘導培養(yǎng)基誘導ADMSCs，對成骨誘導組行茜素紅染色，對成脂誘導組進行油紅O染色，檢測其多向分化潛能。
　　3.分別利用5-aza和將ADMSCs注射心肌組織內(nèi)，誘導ADMSCs定向心肌分化，用免疫熒光技術(shù)檢測心肌特異性標記cTnT的表達情況。
　　4.用DAPI、PKH26、GFP分別標記ADMSCs后種植在Atelocollagen膠原支架上進

4、行三維培養(yǎng)，觀察計算不同方法的標記率。
　　5.將ADMSCs種植于三維支架上分別經(jīng)5-aza和在大鼠心肌組織內(nèi)的微環(huán)境誘導，在不同時間點觀察支架上的ADMSCs向心肌分化的情況，用免疫熒光技術(shù)檢測心肌特異性標記cTnT的表達。觀察Atelocollagen膠原支架在心肌內(nèi)降解時間，檢測支架內(nèi)ADMSCs縫隙連接蛋白Cx43的表達，分析移植的細胞與宿主心肌細胞是否發(fā)生功能聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)的小鼠ADM

5、SCs，經(jīng)流式細胞儀檢測顯示，CD29表達率為94％、而CD45陽性率僅為0.19％，符合目前國際上公認的間充質(zhì)干細胞表面分子特征，證明所培養(yǎng)的細胞為脂肪來源的間充質(zhì)干細胞。
　　2.成脂誘導14天，成骨誘導21天后，ADMSCs可分化為脂肪樣細胞和骨樣細胞，顯示ADMSCs具有多向分化潛能。
　　3.5-aza和大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境均可使ADMSCs分化為心肌樣細胞，但心肌微環(huán)境的誘導分化效率明顯高于5-aza組，且具有時間

6、依賴性，體內(nèi)移植組1周分化效率(42.93±4.04)％大于5-aza組3周的效率（33.33±3.79）％，P＜0.05。
　　4.DAPI、PKH26、GFP三種方法標記后的ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上生長并增殖，標記率分別為DAPI(92.7％)、PKH26(89.2％)、GFP(95％)。
　　5.3d時移植的支架內(nèi)可見極少量ADMSCs，大部分移植細胞遷移至支架外。7d時部分移植細胞cTnT

7、呈陽性，Cx43呈陰性，13d時支架完全降解。支架上的細胞在5-aza誘導和在體內(nèi)微環(huán)境誘導均能使ADMSCs向心肌方向分化。
　　結(jié)論：
　　(1)大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境對小鼠ADMSCs定向心肌分化誘導效率高于體外5-aza誘導。(2)ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上良好生長并增殖，體外經(jīng)5-aza誘導和體內(nèi)心肌微環(huán)境誘導均能使ADMSCs分化為心肌細胞，但移植到心肌內(nèi)后，支架上細胞遷移至支架外，并部分分