介孔碳納米粒的表面修飾及其生物相容性研究.pdf

1、在生物醫(yī)藥領域眾多具有應用前景的納米材料中，碳基納米材料占據(jù)著重要的地位，如碳納米管、石墨烯和介孔碳材料等，其中介孔碳納米材料是一類新型具有較大應用潛能的多孔碳納米材料。它具有大的比表面積和孔容，能提供高的載藥能力;具有可調(diào)的孔徑結構和孔隙，可以控制內(nèi)裝藥物分子的釋放，在藥物傳送系統(tǒng)領域有較好的應用前景，然而在用于臨床之前，必須充分了解納米材料的物理化學性質(zhì)和不良的生理反應，仔細的評估毒性和生物相容性。前期研究中本課題組成功制備了PEG

2、修飾的氧化介孔碳納米粒作為抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)的載體，該納米粒具有良好的親水性和很高的載藥量，DOX的釋放具有pH響應性，同時在體內(nèi)外具有良好的抗腫瘤活性。其他已有的研究也表明，在碳納米材料表面修飾或嫁接某些親水性分子如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可改善碳納米材料的分散性和血液穩(wěn)定性，顯著提高載體吸附藥物的能力和在循環(huán)系統(tǒng)半衰期，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲以防止藥物在傳遞過程中的非特異性釋放，從而提高碳納米材料的生物

3、相容性。
　　因此本課題擬在前期工作基礎上，用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)對介孔碳納米粒進行表面修飾，從細胞水平、免疫系統(tǒng)作用和整體動物水平研究修飾前后介孔碳納米粒的生物相容性，為介孔碳材料未來在臨床醫(yī)藥領域的可能應用提供一定的依據(jù)。
　　第一章主要介紹了介孔碳納米粒的合成、表面修飾及相關表征。我們通過低濃度水熱合成法成功制備了介孔碳納米粒，透射電鏡等檢

4、測表明介孔碳納米粒為較規(guī)則的球形，粒徑均一，約為90nm，同時具有良好的有序介觀結構。主要依靠介孔碳納米粒強吸附作用在其表面進行修飾，并通過透射電鏡、傅立葉紅外光譜、熱重分析、核磁、紫外-可見分光光度計和馬爾文粒徑儀等對修飾前后的介孔碳納米粒進行了較系統(tǒng)的表征，表明PVP和DSPE-mPEG2000成功的修飾到介孔碳納米粒的表面，并提高了其在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性。細胞攝取實驗結果表明，介孔碳納米粒可以在較短時間內(nèi)(2h)被正常細胞或

5、腫瘤細胞攝取。
　　第二章主要是測定了修飾前后介孔碳納米粒的細胞毒性和對細胞的氧化應激水平的影響。通過CCK-8實驗、細胞凋亡實驗、活性氧檢測等方法測定表明，在低于100μg/ml濃度范圍內(nèi)，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG與L929細胞共孵育24h時，MCN表現(xiàn)出輕微的細胞毒性，而PVP和DSPE-mPEG2000對MCN的表面修飾能降低其對L929細胞的毒性;而48h時，不同濃度的MCN細胞存活率有所提高，說明MCN本身

6、對L929細胞的毒性較低。修飾和未修飾的介孔碳納米粒與HeLa細胞共孵育24h或48h后，均未觀察到細胞毒性作用，說明介孔碳納米粒是相對安全的。細胞凋亡實驗結果也表明，修飾和未修飾的介孔碳納米粒不會誘導L929和HeLa細胞發(fā)生凋亡。細胞內(nèi)ROS水平測定表明，MCN可顯著誘導L929和HeLa細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，產(chǎn)生ROS量隨著納米粒濃度的增加而增多，但修飾后的介孔碳納米粒相比未修飾前可顯著降低刺激細胞產(chǎn)生ROS的量，降低細胞氧化應激水

7、平和介孔碳納米粒對細胞的刺激性。
　　第三章我們完成了介孔碳納米粒的初步免疫毒性評價。100μg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG刺激能夠mDCs表面分子CD11c、I-Ab、CD40表達量升高，促進mDCs表型成熟。濃度為100μg/ml時，PVP和DSPE-mPEG2000修飾后介孔碳納米粒能顯著的降低未修飾介孔碳納米粒刺激小鼠樹突狀細胞分泌的炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的水平。在25～100μg/ml濃度范圍

8、內(nèi)，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG能誘導T淋巴細胞的凋亡，并且隨著納米粒濃度的增大T淋巴細胞凋亡的越多。高濃度時，對T淋巴細胞有較高的免疫毒性，PVP和DSPE-mPEG2000修飾后沒有明顯的降低T淋巴細胞的凋亡率。通過生物透射電子顯微鏡的觀察到介孔碳納米粒通過細胞的內(nèi)吞進入到RAW264.7細胞，并在細胞質(zhì)中聚集，作為藥物載體可以攜帶藥物穿過細胞膜。修飾和未修飾的介孔碳納米粒對RAW264.7細胞毒性小，可能由于小鼠巨噬細胞

9、較強的吞噬和降解處理能力有關。
　　第四章介孔碳納米粒的生物毒性效應初步研究。MCN、MCN-PVP和MCN-PEG濃度在0～100μg/ml范圍內(nèi)均無溶血現(xiàn)象（HR％＜5％），說明介孔碳納米粒具有良好的血液相容性。連續(xù)7天尾靜脈注射劑量為0.2ml/10g、濃度為1mg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG后，各器官的組織切片說明納米粒不會引起小鼠的組織纖維化、變性和壞死等病理性改變。但是在肺組織切片中可以觀察到聚齊的介

10、孔碳納米粒，可能是由于其在體內(nèi)的血流動力學影響，PVP或DSPE-mPEG2000修飾后的介孔碳納米?？梢詼p少在肺的殘留量，因為介孔碳納米粒容易在血管壁沉積，而修飾后的納米粒分散性提高，提高MCN-PVP和MCN-PEG在血管中的流動性。介孔碳納米粒不影響小鼠的肝腎功能，也沒有激活小鼠的補體C3。
　　以上結果表明，本課題成功制備了介孔碳納米粒，并成功的將生物相容性的高分子PVP和PEG修飾到介孔碳納米粒的表面。從細胞水平實驗可以