對(duì)葉榕榕果和四種榕小蜂的細(xì)菌多樣性.pdf

1、昆蟲(chóng)作為陸地上最成功和最龐大的生物類(lèi)群，對(duì)多種生態(tài)環(huán)境都具有高度的適應(yīng)性。昆蟲(chóng)的這種適應(yīng)性除了與自身的生理構(gòu)造和機(jī)能相關(guān)外，很大程度上還得益于微生物共生菌的幫助。昆蟲(chóng)宿主相關(guān)的微生物共生體參與宿主的多種生命過(guò)程，包括營(yíng)養(yǎng)、免疫、生存適度、繁殖以及與昆蟲(chóng)宿主的共進(jìn)化和共物種形成等。榕果-傳粉榕小蜂共生體系是闡釋昆蟲(chóng)和植物之間共生和協(xié)同進(jìn)化的重要經(jīng)典模型。經(jīng)過(guò)上百萬(wàn)年的進(jìn)化，傳粉榕小蜂和榕樹(shù)之間幾乎形成了嚴(yán)格的“一對(duì)一”模式。
　　在

2、研究?jī)煞N大生物的共生過(guò)程中，已經(jīng)有越來(lái)越多的生態(tài)學(xué)家開(kāi)始關(guān)注細(xì)菌或真菌，這類(lèi)第三方參與者在互利共生過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。但是到目前為止，除了知道Wolbachia在榕小蜂中具有非常高的發(fā)生和分布率外，我們對(duì)榕果-榕小蜂互利共生系統(tǒng)中的其他微生物群體了解的還非常少。Janzen通過(guò)觀察和論證榕果環(huán)境的特殊性，推測(cè)認(rèn)為榕果果腔應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌環(huán)境。Miller采用培養(yǎng)法從無(wú)花果中培養(yǎng)到真菌和細(xì)菌各一株。近期，Martinsin采用非培養(yǎng)的方法從六

3、種榕樹(shù)和傳粉榕小蜂中檢測(cè)到大量真菌。我們推測(cè)榕樹(shù)榕小蜂系統(tǒng)中應(yīng)當(dāng)還有大量的細(xì)菌微生物的存在，這些細(xì)菌微生物在榕樹(shù)榕小蜂的共生過(guò)程中可能扮演者非常重要的角色。根據(jù)環(huán)境選擇假說(shuō)和元基因組理論，在特殊的果內(nèi)環(huán)境選擇壓力下，榕果榕小蜂相關(guān)微生物群體組成或者基因進(jìn)化等應(yīng)當(dāng)先于榕小蜂發(fā)生變化，以幫助榕小蜂適應(yīng)榕果的選擇壓力。這為驗(yàn)證微生物的環(huán)境選擇假說(shuō)和元基因組進(jìn)化理論提供了良好的模型。
　　本研究中，我們以16SrDNA克隆文庫(kù)和傳粉榕小蜂

4、基因組為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，調(diào)查了對(duì)葉榕榕果子房和四種榕小蜂相關(guān)細(xì)菌微生物的多樣性。對(duì)此，我們希望可以解決如下幾個(gè)問(wèn)題:1）榕果環(huán)境是否為前人所認(rèn)為的無(wú)細(xì)菌環(huán)境？2）本系統(tǒng)的細(xì)菌群體和開(kāi)放或者半開(kāi)放環(huán)境中的是否不同？3）榕小蜂相關(guān)的細(xì)菌群體來(lái)源于榕果、親代小蜂還是其它渠道？4）同一微環(huán)境中密切聯(lián)系的四種榕小蜂是否具有相似的細(xì)菌群體？5）是否還存在其它的類(lèi)似Wolbachia的垂直傳播的共生細(xì)菌存在？
　　通過(guò)對(duì)對(duì)葉榕四種榕小蜂(Cerato

5、solen solmsi,Philotypesis pilosa,P.sp.and Apocrypta bakeri)相關(guān)細(xì)菌微生物的13個(gè)16SrDNA克隆文庫(kù)的研究發(fā)現(xiàn):1)對(duì)葉榕榕小蜂相關(guān)的細(xì)菌微生物具有多樣性;2）在高級(jí)分類(lèi)水平上，榕小蜂和果外環(huán)境中的昆蟲(chóng)具有類(lèi)似的多樣性;在低級(jí)分類(lèi)水平上，榕小蜂表現(xiàn)出特有的細(xì)菌群體結(jié)構(gòu);3）不同種類(lèi)的榕樹(shù)及其榕小蜂可能具有不同的細(xì)菌群體多樣性。
　　由于榕小蜂種類(lèi)或者生活習(xí)性的不同，存在

6、于同一微型果腔內(nèi)的四種榕小蜂表現(xiàn)出不同的細(xì)菌微生物結(jié)構(gòu)特征:1）不同種類(lèi)榕小蜂相關(guān)細(xì)菌群體表現(xiàn)為種內(nèi)差異小和種間差異大;2）四種榕小蜂的相關(guān)細(xì)菌多樣性可以分為三種完全不同的組成，即C.solmsi組、P.pilosa組、A.bakeri和P.sp.組;3）傳粉榕小蜂C.solmsi的細(xì)菌多樣性具有典型的植食性昆蟲(chóng)的特征，以Enterobacteriaceae科為最主要的優(yōu)勢(shì)菌群;4）同科不同屬的非傳粉榕小蜂A.bakeri和P.sp.具

7、有相同的擬寄生寄主，菌群組成結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，以Tepidimonas屬為優(yōu)勢(shì)菌群;5）P.pilosa的菌群組成既有別于同科同屬的P.sp.也不同于幼蟲(chóng)前期擬寄居的C.solmsi,體現(xiàn)了其潛在的雜食性特征;6）四種榕小蜂的菌群分布格局超越了榕小蜂親緣關(guān)系的范圍，表現(xiàn)出和榕小蜂的生態(tài)位或食性的完美對(duì)應(yīng)。
　　本研究首次采用磁珠細(xì)胞破碎和化學(xué)提取相結(jié)合的方法提取了對(duì)葉榕AB期榕果子房的細(xì)菌DNA模板;然后通過(guò)設(shè)計(jì)榕果子房相關(guān)細(xì)菌微

8、生物的部分16S rDNA序列的特異性引物，在PCR過(guò)程中成功排除了葉綠體DNA的干擾，構(gòu)建了4個(gè)C.solmsi產(chǎn)卵前后的16S rDNA克隆文庫(kù)。通過(guò)對(duì)AB期對(duì)葉榕榕果子房的細(xì)菌微生物研究發(fā)現(xiàn):1）密閉果腔中的AB期子房具有細(xì)菌多樣性，打破了子房“無(wú)細(xì)菌”的假說(shuō);2）傳粉榕小蜂C.solmsi產(chǎn)卵前后，總體上子房細(xì)菌結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，存在部分菌群的微小變化;3）榕果子房具有獨(dú)特的細(xì)菌群體組成，以Delftia屬和Acinetobacte

9、r屬等為主要優(yōu)勢(shì)菌群。
　　C.solmsi在子房中產(chǎn)卵后，子房中Acinetobacter屬出現(xiàn)Accs支系，通過(guò)分析我們推測(cè)其是經(jīng)過(guò)C.solmsi產(chǎn)卵發(fā)生垂直傳播。1）產(chǎn)卵前，Accs在子房中未被檢測(cè)到，但產(chǎn)卵后，Accs在子房中的豐度約為12％，是Acfh的3～4倍;2)Accs在所有的C.solmsi克隆文庫(kù)中都穩(wěn)定存在，豐度和胞內(nèi)共生菌Wolbachia相近，約2.2％;3）Accs在NCBI序列的最高相似度僅為97％

10、，在系統(tǒng)樹(shù)上聚為單獨(dú)一個(gè)支系;4)Accs支系和Acfh支系的序列在18個(gè)位點(diǎn)存在穩(wěn)定的堿基差異。
　　C.solmsi基因組數(shù)據(jù)類(lèi)似于一個(gè)hologenome，包含了大量的微生物信息。通過(guò)對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒等的序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):1）未組裝基因組中微生物多樣性的規(guī)模極大的超過(guò)克隆文庫(kù)的多樣性，可以更加全面的反應(yīng)相關(guān)微生物的組成信息;2）完成組裝的基因組中的微生物信息具有偏好性，主要基本上只包含高豐度菌群的序列信息，與克隆文庫(kù)的