擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂雌激素相關(guān)受體基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、核受體組成一個(gè)蛋白質(zhì)大家族，它們作為配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。在這個(gè)大家族里面，有一些受體分子沒(méi)有已知的配體，稱它們?yōu)楣聝汉耸荏w。雌激素相關(guān)受體(ERR α, ERRB，andERRγ)屬于孤兒核受體，在結(jié)構(gòu)上和ER非常類似，它們和ER共同構(gòu)成核受體超家族的第三亞族，它們能夠直接與類固醇激素受體共激活子結(jié)合激活靶基因的表達(dá)。研究表明，哺乳動(dòng)物ERRs參與ER信號(hào)通路，與眾多生理和發(fā)育過(guò)程有關(guān)，參與細(xì)

2、胞的增殖與分化。擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂屬于社會(huì)性昆蟲(chóng)，它們與人類關(guān)系密切，是重要的資源昆蟲(chóng)，對(duì)于它們生殖與發(fā)育的相關(guān)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂為研究材料，采用RT-PCR、5’與3'Race、熒光實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)這兩種昆蟲(chóng)雌激素相關(guān)受體基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)研究，以期為進(jìn)一步的探討昆蟲(chóng)中雌激素相關(guān)受體的功能奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1．?dāng)M黑多刺蟻雌激素相關(guān)受體基因pvERR全長(zhǎng)193

3、5bp，包含一個(gè)1305bp的開(kāi)放閱讀框、245bp的5’-UTR和385bp的3’-UTR，編碼一個(gè)由434個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量49.0989KD，理論等電點(diǎn)為6.62。pvERR基因有八個(gè)外顯子和七個(gè)內(nèi)含子。將pvERR基因核苷酸序列上傳Genbank，序列號(hào)為：EF474463。 2．意大利蜜蜂雌激素相關(guān)受體基因amERR全長(zhǎng)1779bp，包含一個(gè)1305bp的開(kāi)放閱讀框、197bp的5’-UTR和277bp的3’

4、-UTR，編碼一個(gè)由434個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量49.131KD，理論等電點(diǎn)為7.43。amERR基因有八個(gè)外顯子和七個(gè)內(nèi)含子。將amERR基因核苷酸序列上傳Genbank，序列號(hào)為：EF506198。 3．同源性分析表明，pvERR和amERR的氨基酸序列相似性為89.9％；它們的氨基酸序列與三種雙翅目昆蟲(chóng)(埃及伊蚊aaERR、斯氏按蚊asERR和黑腹果蠅dERR)ERRs的相似性都在50.2％～53％之間；它們與人類三

5、種ERRs的相似性在37.6％～44％之間?；贜J法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，pvERR和amERR形成一支，與所有已知的昆蟲(chóng)ERRs聚在一起；它們與人類ERRs的關(guān)系比雙翅目昆蟲(chóng)與人類的更近，也就是說(shuō)，單從ERRs來(lái)看，在進(jìn)化關(guān)系上，pvERR和amERR比aaERR、asERR和dERR都要進(jìn)化。 4．采用APSSP2法對(duì)pvERR和amERR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在pvERR和amERR蛋白的DNA結(jié)合區(qū)(DBD，105～

6、177)，有四個(gè)B折疊和三個(gè)α螺旋，主要由序列中位于110、113、117、120位的半胱氨酸(Cys，C)形成第一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；由位于136、142、152、155位的半胱氨酸(Cys，C)形成第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。pvERR和amERR蛋白的配體結(jié)合區(qū)(LBD，206～429)，主要由兩個(gè)β折疊和11個(gè)α螺旋(H1～H12)構(gòu)成，而多數(shù)ERR的LBD是一個(gè)由12個(gè)α螺旋(H1～H12)形成的三明治式的結(jié)構(gòu)，通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)pvERR和amER

7、R蛋白都缺少H2，這與哺乳類已知晶體結(jié)構(gòu)的ERR),的配體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)非常類似。 5．采用SwissModel First Approach對(duì)pvERR和amERR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，pvERR和amERR蛋白的DBD結(jié)構(gòu)與人類ERRB的DBD結(jié)構(gòu)非常相似；amERR與pvERR的LBD的空間結(jié)構(gòu)差別是amERR的最后一個(gè)α螺旋是向模型內(nèi)部伸入的，而pvERR的則是向外伸出的，這與它們的親水性有關(guān)。配體結(jié)合區(qū)的AF-2恰好

8、是在最后一個(gè)α螺旋區(qū)(H11)，AF-2的結(jié)構(gòu)和功能因結(jié)合的配體類型不同而不同，所以這說(shuō)明amERR與pvERR的配體存在一定的差異。 6．采用2<'-△△CT>法，對(duì)擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段和不同品級(jí)中pvERR mRNA和意大利蜜蜂不同發(fā)育階段和不同品級(jí)中amERR mRNA的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示，隨著昆蟲(chóng)發(fā)育，pvERR和amERR基因的mRNA表達(dá)量逐漸增加，成蟲(chóng)中的表達(dá)量高于幼蟲(chóng)期；在不同品級(jí)中，蟻后pvER

9、R mRNA的表達(dá)量高于工蟻和雄蟻，雄蟻中的最低；蜂王amERR mRNA的表達(dá)量高于工蜂和雄蜂，雄蜂中的最低。結(jié)果表明，社會(huì)性昆蟲(chóng)雌激素相關(guān)受體基因mRNA的表達(dá)模式非常相似，ERR可能與社會(huì)性昆蟲(chóng)的發(fā)育有關(guān)；pvERR和amERR基因的mRNA在蛹期到成蟲(chóng)期相對(duì)表達(dá)量有了顯著增加，可能說(shuō)明它們?cè)诔上x(chóng)的組織分化中具有重要作用；成蟲(chóng)階段pvERR和amERR基因的mRNA表達(dá)量均高于幼蟲(chóng)期，說(shuō)明昆蟲(chóng)組織中ERR可能與哺乳動(dòng)物的ERRs一

10、樣分布比較廣泛，而不同品級(jí)間的表達(dá)差異可能與它們?cè)谏鐣?huì)性群體中的職能有關(guān)。 7．對(duì)擬黑多刺蟻不同品級(jí)腦中pvERR mRNA的表達(dá)進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示，pvERR mRNA在不同品級(jí)的蕈形體、附葉、視葉、中腦、食道下神經(jīng)節(jié)和球狀細(xì)胞中有表達(dá)。在蟻后腦中，蕈形體和球狀細(xì)胞中pvERR mRNA的陽(yáng)性表達(dá)最為明顯，食道下神經(jīng)節(jié)、附葉和視葉中的次之，而中腦和中央體中的表達(dá)最弱。pvERR mRNA的表達(dá)模式可能與蟻后在蟻群中的職

11、能和地位是相關(guān)的，說(shuō)明pvERR可能與視覺(jué)方面的學(xué)習(xí)記憶以及求偶調(diào)節(jié)等有關(guān)。在工蟻腦中，蕈形體、視葉、附葉和球狀細(xì)胞中的陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度跟蟻后相似，但是在中腦的陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于蟻后和雄蟻。工蟻在蟻群中的行為最為復(fù)雜，pvERR mRNA在工蟻蕈形體及中腦的表達(dá)模式，可能說(shuō)明pvERR與工蟻的嗅覺(jué)辨別以及學(xué)習(xí)與記憶功能有關(guān)。與蟻后和工蟻相比，pvERR mRNA在雄蟻蕈形體、附葉以及食道下神經(jīng)節(jié)的表達(dá)強(qiáng)度弱于蟻后和工蟻，但視葉中有較強(qiáng)的表

12、達(dá)。雄蟻的職責(zé)是與蟻后交配，而視覺(jué)信息在求偶過(guò)程中具有重要作用，所以推測(cè)pvERR mRNA在視葉和蕈形體的表達(dá)與視覺(jué)信息的整合有關(guān)，進(jìn)而對(duì)求偶行為起調(diào)控作用。 8．采用地高辛標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針對(duì)擬黑多刺蟻性腺中pvERR mRNA的表達(dá)進(jìn)行了原位雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示，pvERR mRNA在卵子發(fā)生過(guò)程中濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)和生長(zhǎng)期、卵黃發(fā)生期的卵母細(xì)胞有表達(dá)；在變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強(qiáng)的表達(dá)。在卵子發(fā)生早期階段，

13、濾泡細(xì)胞中pvERR mRNA的陽(yáng)性表達(dá)可能與它們自身的增殖和分化有關(guān)。卵母細(xì)胞生長(zhǎng)階段，濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達(dá)模式可能說(shuō)明濾泡細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供了發(fā)育信息，而卵黃生成期卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達(dá)可能說(shuō)明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關(guān)。變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強(qiáng)pvERR mRNA的表達(dá)，說(shuō)明pvERR可能參與了精細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟。 本項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)在社會(huì)性昆蟲(chóng)中存在雌激素